Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
градиенте плотности CsCl. Не центрифугируйте фаг дольше, чем это
необходимо для осветления. При излишнем сжатии осадка частицы фага могут
повредиться, что приведет к потерям ДНК.
3. (Этап 6); если фаг не подвергался излишнему сжатию, то его очень легко
суспендировать. Тем не менее лучше оставить осадок фага набухать в
жидкости в течение нескольких часов на холоду перед тем, как
суспендировать его, применяя физическое воздействие. При втором, очень
кратковременном центрифугировании удаляются остатки обломков клеток и
агара, а фаг не теряется. Если из препарата будете выделять ДНК, а он
загрязнен агаром, то
проведение этапа 6 обязательно.
Методика 3
Быстрый метод получения трансдуцирующего фага Р22
1. Засейте 1 мл бульона LB тем штаммом, который хотите использовать в
качестве донора. Вырастите культуру до насыщения. После инкубации в
течение ночи при 37°С культура должна содержать 2-109 клетка/мл.
3. Быстрый метод получения трансдуцирующего фага Р22
63
2. Заразите фагом Р22 (НТ, int~) с множественностью 0,01-0,1 фаговых
частиц на клетку. Обычно к 1 мл ночной культуры добавляют 4 мл бульона
Р22. Бульон Р22 - это бульон LB с полным количеством солей Е (1х),
содержащий 0,2% глюкозы и 5-106 БОЕ/мл фага Р22 (НТ, int~). В такой среде
фаг довольно стабилен при комнатной температуре. Используемый мутант
фага- Р22 осуществляет неспецифическую трансдукцию с повышенной частотой
(НТ; Schmieger, 1972) и не образует устойчивых лизогенов (intr).
3. Инкубируйте в течение 5-18 ч при 37°С при встряхивании. Культура может
не просветлеть.
4. Низкоскоростным центрифугированием удалите клетки и их обломки.
5. Надосадочную жидкость перенесите в пробирку с 0,5 мл хлороформа,
перемешайте в смесителе.
6. Оттитруйте лизат (см. методику 1). Он должен содержать 1010-1011
частиц фага в 1 мл.
Обсуждение
Следует заметить, что при суспендировании отдельной бляшки фага Р22 в 4
мл бульона LB получается суспензия с концентрацией около 106 частиц фага
в 1 мл. Поэтому такую суспензию можно использовать как источник фага для
получения препарата из отдельной бляшки любого фага Р22 описанным выше
методом.
Литература
Schmieger Н., 1972. Phage Р22 mutants with increased or decreased
transduction abilities, Mol. Gen. Genet., 119, 75.
Методика 4
Очистка фага
Эти методики можно использовать последовательно, а можно прямо приступать
к равновесному центрифугированию.
1. Ступенчатые градиенты CsCl для ротора Beckman 50.1
А. Для очистки от белков фаг лучше всего осадить в растворе CsCl из
верхней части пробирки.
64
Раздел II. Методики
1. На дно нитроцеллюлозной пробирки размером 7гХ2 дюйма1 от центрифуги
Beckman налейте 1 мл раствора 5,0 М CsCl, 10 мМ MgS04, Ю мМ трис (pH 8) и
0,1 мМ 1Ча2-ЭДТА
(р = 1,6).
2. Наслоите 3 мл раствора 3,0 М CsCl, 10 мМ MgS04, 10 мМ трис (pH 8) и
0,1 мМ 1Ча2-ЭДТА (р=1,4).
3. Наслоите 1 мл суспензии фага в буфере для разведения фага К (10 мМ
MgS04 и 10 мМ трис, pH 7,5). Если фаг уже находится в растворе CsCl (р -
1,5), то сначала разведите 0,5 мл такой суспензии фага 0,5 мл буфера для
разведения фага К.
4. Центрифугируйте в роторе SW50.1 при 30 000 об/мин В течение 1 ч при
20°С.
5. Шприцом на 1 мл с иглой 5/8 дюйма номер 25 проколите пробирку сбоку и
отберите фаг. Отбирайте не более 0,5 мл.
Б. Для очистки от ДНК и РНК лучше всего сделать так, чтобы фаг всплыл со
дна пробирки в растворе CsCl.
1. На дно нитроцеллюлозной центрифужной пробирки налейте 0,5 мл фага,
суспендированного в растворе CsCl с плотностью, соответствующей плавучей
плотности фага (т. е. с Р-1>5) •
2. Добавьте равный объем (0,5 мл) насыщенного (при 25°С) раствора CsCl
(7,2 М) в 10 мМ MgS04, 10 мМ трис. (pH 8) и 0,1 мМ 1Ча2-ЭДТА (р = 1,92).
Хорошо перемешайте.
3. Наслоите 3 мл раствора 5,0 М CsCl в 10 мМ MgS04, 10 мМ
трис (pH 8) и 0,1 мМ 1Ча2-ЭДТА (р = 1,6).
4. Наслоите 1 мл раствора 3,0 М CsCl в 10 мМ MgS04, 10 мМ
трис (pH 8) и 0,1 мМ 1Ча2-ЭДТА (р=1,4).
5. Центрифугируйте в роторе SW50.1 при 30 000 об/мин в течение 1 ч при
20°С.
6. Шприцом на 1 мл с иглой 5/8 дюйма номер 25 проколите пробирку сбоку и
отберите фаг. Отбирайте не более 0,5 мл.
II. Равновесный градиент для ротора SW 50.1
1. Перенесите фаг, суспендированный в 4,0 М CsCl, 10 мМ MgS04, 10 мМ
трис( pH 8) и 0,1 мМ Ма2-ЭДТА (раствор CsCl с плотностью равной плавучей
плотности фага) в нитро-целлюлозную пробирку размером 7гХ2 дюйма от
центрифуги Beckman.
2. Центрифугируйте в роторе SW50.1 при 30 000 об/мин при 20°С в течение
по крайней мере 16 ч.
1 1 дюйм равен примерно 2,5 см. -¦ Прим. ред.
4. Очистка фага
65
3. Шприцом на 1 мл с иглой 5/8 дюйма номер 25 проколите пробирку сбоку и
отберите фаг.
4. Отбирайте не более 0,5 мл.
Обсуждение
I. А. Как фаг X, так и фаг Р22 имеют плотность около 1,5 г/мл.
Точная плотность фага X зависит от того, сколько в нем содержится ДНК. С
увеличением количества ДНК в частице плотность фага возрастает.
Ступенчатый градиент состоит из двух слоев раствора CsCl с плотностями
