Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
степени разведения и высеянный объем. Так, если высеяли 0,05 мл
разведения 10~7, то напишите на чашке 7/0,05.
60
Раздел II. Методики
Методика 2
Получение препаратов фага
I. Клетки-хозяева (см. методику 1)
II. Засев чашек
1. Смешайте 10(r) частиц фага с 20-100 мкл культуры клеток-хозяев.
2. Инкубируйте 15 мин при 37 или 25°С. В случае фага Р22 этого можно не
делать.,
3. Смешайте смесь с 2,5 мл мягкого агара LB (при 47°С) и вылейте на
влажную (свеже разлитую) чашку LB.
4. Инкубируйте не переворачивая в закрытом (влажном) ящике при 37°С.
III. Сбор фага
1. После того как наступит сплошной лизис (примерно через 6 ч), охладите
чашки, перенеся их в холодную комнату.
2. Налейте по 5 мл холодной среды для разведения фага X (10 мМ трис, pH
7,5 и 10 мМ MgS04) на чашку. Оставьте чашки на ночь в холодной комнате.
3. Соберите налитую на чашки жидкость, добавьте в нее 2 капли СНС13 (с
этанолом). На этой стадии неочищенный препарат фага может храниться при
5°С в течение нескольких лет. Можно заложить его и на длительное хранение
(см. приложение 3). Если полученный препарат фага X будет использован для
выделения ДНК, то нужно тщательно избегать загрязнения суспензии фага
кусочками агара и перейти к следующему этапу.
4. Чтобы удалить обломки клеток, проведите низкоскоростное
центрифугирование (около 10000 об/мин в течение 10 мин) в роторе Sorvall,
SS-34 или Beckman JA-20.
5. Чтобы осадить фаг, центрифугируйте в течение 3 ч при 20 000 об/мин.
6. Ресуспендируйте фаг в 1 мл среды для разведения фага X (см.
обсуждение). Перенесите суспензию в пробирку на 1,5мл от микрофуги
Eppendorf и центрифугируйте в течение 5 с, чтобы удалить остатки обломков
клеток. Полученные на этой стадии препараты можно использовать для
выделения ДНК, а можно и хранить.
7. Для дальнейшей очистки фага (и чтобы получить более устойчивые
препараты) следуйте методике 4-IA.
2. Получение препаратов фага
61
С одной чашки получается примерно 4 мл суспензии фага с концентрацией 2 •
1010 частица/мл или около 10 мкг очищенной ДНК.
Обсуждение
I. См. методику 1.
II. 1. Количество фага и клеток, высеваемых на чашку, зависит
от размера бляшек. Наиболее высокие титры препаратов получаются тогда,
когда бляшки на чашке соприкасаются, давая сплошной лизис. Если бляшки
сильно перекрываются, то клетки газона убиваются слишком рано, чашки
получаются очень прозрачными, а выход фага - низким. Если бляшки не
перекрываются, то заражено слишком мало клеток, что приводит к низкому
выходу фага. Однако точное соотношение фага и клеток не имеет
критического значения.
2. Инкубация фага и клеток в высоких концентрациях гарантирует хорошую
адсорбцию.
3. Агар не следует охлаждать ниже 47°С, так как в противном случае он
начнет затвердевать. Если же он окажется намного горячее, то погибнет
много клеток. Если агар был расплавлен не полностью, то чашка после
инкубации будет рябой и бляшки будут плохо различимы. Следует наливать в
чашки тонкий слой нижнего агара. Он должен быть влажным, чтобы растущие
бляшки соприкоснулись и получился сплошной лизис.
4. При инкубации чашек крышками вверх конденсат капает на газон, что
помогает получению сплошного лизиса. Обычно мы инкубируем чашки в большом
закрытом пластмассовом ящике, на дно которого уложены влажные бумажные
полотенца.
III. 1. (Этапы 1 и 2); если урожай фага снимать с чашек до
наступления сплошного лизиса или спустя несколько часов по его
достижении, то получаются препараты с пониженным титром. Момент
наступления сплошного лизиса зависит от размера бляшек, количества
высеянных на чашку фага и клеток, а также от скорости роста клеток. В
случае фага дикого типа при описанных выше условиях сплошной лизис
наступает примерно через 6 ч. Если фаг образует мелкие бляшки, то это
время может возрасти до 8 ч. Когда чашки охлаждают, верхний агар
становится более твердым и уже не смещается при наслаивании жидкости. За
ночь фаг из верхнего агара диффундирует в налитую на чашку жидкость.
62
Раздел II. Методики
2. (Этапы 3, 4 и 5); добавляют хлороформ, поскольку он убивает все клетки
и предотвращает бактериальный рост при длительном хранении. Чтобы в
хлороформе не накапливались продукты окисления, в него добавляют этиловый
спирт [несколько капель на пинту (~0,5 дм3) хлороформа]. На этой стадии
полученный с чашек препарат фага можно хранить. Если такие препараты
поместить в герметически закрытые пробирки, их можно хранить в течение
примерно 5 лет. Если из очищенного фага будете выделять ДНК, то работайте
аккуратно и
не захватите кусочков агара, который является мощным ингибитором многих
ферментов, работающих на ДНК. Его не так просто удалить и при Очистке в
градиенте плотности CsCl, так как часть агара обладает той же плотностью,
что и фаг, и характеризуется высоким коэффициентом седиментации. Если же
выделяемый препарат фага будет все же загрязнен агаром, то часть этого
агара можно удалить, проведя центрифугирование перед очисткой фага в
