Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
1,6 и
1,4 г/мл. Осаждающийся при центрифугировании фаг задерживается на
границе между этими растворами. После того как растворы наслоены, следует
отметить границу между ними, нанеся черту снаружи пробирки. Это поможет
определить положение полосы фага после центрифугирования. Плотность
белковых примесей составляет около 1,3 г/мл, и в растворе CsCl с
плотностью 1,4 г/мл они должны всплывать. Плотность ДНК и РНК, однако,
больше плотности фага, и поэтому они могут оказаться размазанными по
всеми градиенту.
Б. Это обращенный ступенчатый градиент, в котором фаг всплывает к границе
между слоями с разными плотностями. При смешивании суспензии фага в
растворе CsCl с плотностью, равной плавучей плотности фага (р = 1,5), с
равным объемом насыщенного раствора CsCl получается раствор с плотностью
1,7 г/мл. Примеси ДНК (р = 1,7) и РНК (р=1,9) должны отделяться от
всплывающего фага.
II. При использовании этого метода достигается хорошая очистка, но
требуется более продолжительное центрифугирование. Примеси РНК, ДНК и
некоторых белков за 16 ч равновесия не достигают и оказываются
распределенными по всему градиенту. Данный метод обладает тем
преимуществом, что градиент, в котором фаг концентрируется при
равновесной плотности, оказывается гораздо более пологим, чем описанный
выше ступенчатый градиент. Поэтому если препарат фага гетерогенен и
содержит частицы с ДНК разной длины, то после центрифугирования можно
обнаружить не одну, а несколько полос фага.
Слабую полосу фага лучше всего наблюдать, направив на пробирку сверху
коллимированный пучок света от осветителя для микроскопа. Поломы лучше
выявляются, если за пробиркой поместить черный экран.
3-301
66
Раздел II. Методики
burst size
On! В лаборатории может взрываться (burst) и лопаться многое, в том числе
и эксперименты. Однако "burst size" 1 - это просто число фаговых частиц,
получающихся в отдельной клетке бактерии-хозяина.
Методика 5
Транспозиция элемента 1г\10
I. Получение дефектного трансдуцирующего фага из штамма NK 337
Дефектный трансдуцирующий фаг с транспозоном In 10 получают при индукции
штамма NK337. Этот сложный лизоген (см.
1 Непереводимая игра слов: burst - взрываться, a burst size -
выход
фага.
5. Транспозиция элемента TnlO
67
обсуждение) крайне нестабилен, и его следует хранить при
-70°С или в лиофилизированном виде.
1. Рассейте штамм NK337 до отдельных колоний, проверьте его
температурочувствительность. (Чувствительность к температуре
свидетельствует о наличии профага с мутацией c2ts.) Чувствительность к
температуре проверяют, сравнивая эффективность образования колоний при 30
и при 42°С.
2. Вырастите ночную культуру штамма NK337 объемом 30 мл при комнатной
температуре (ниже 30°С).
3. Разведите культуру, перенеся все 30 мл в 1500 мл супербульона (см.
приложение 1). Культуру в супербульоне вырастите до плотности - 3-108
клетка/мл (СЮб5о = 0,5; в качестве контроля обязательно используйте
супербульон) при температуре 30°С или ниже.
4. Перенесите культуру в качалку в водяной бане на 39°С.
5. Инкубируйте со встряхиванием в течение 3 ч, или пока культура не
лизирует.
6. Добавьте хлороформ (20 мл), перетрясите, подождите и опять
перетрясите. (Клетки в супербульоне, по-видимому, плохо ли-зируют под
действием хлороформа. Повторение в течение 15 мин циклов встряхивания и
нескольких минут покоя приводит, как кажется, к хорошему результату).
7. Проведите низкоскоростное центрифугирование, чтобы удалить обломки
клеток (иногда оказывается необходимым провести несколько повторных
центрифугирований). Соберите надосадочную жидкость. Большинство
препаратов лизирует хорошо и становится прозрачными уже после первого
центрифугирования.
8. Добавьте отростки фага (методику см. ниже).
9. Сконцентрируйте частицы фага, проведя высокоскоростное
центрифугирование (см. методику 2),
10. Титр фага можно определить, проведя трансдукцию штамма TR4368 (his-
644 [Р22 sie А27]) к TetR. Такая трансдукция дает оценку числа
функциональных частице элементом ТпЛО. Этот элемент можно перенести с
помощью трансдукции в профаг реципиента потому, что с обеих сторон от
Тп10 имеются гомологичные профагу последовательности фаговой ДНК. Титр
частиц примерно в 103 раз превышает число трансдуктантов TetR, которые
обнаруживаются в таком опыте.
11. После добавления отростков фага (см. ниже) из 1,5 л культуры
получается 5 -1012 фаговых частиц.
II. Добавление отростков к головкам фага Р22
Многие частицы фага, полученные после индукции клеток, лизогенных по фагу
Р22, оказываются без отростков. Отростки можно присоединить к таким
частицам, пользуясь при-
3*
68
Раздел II. Методики
веденной ниже методикой, в основе которой лежит метод Израиля и др.
(Israel et al., 1967).
Эта методика включает получение лизата мутанта фага, дефектного по
головке. Фаг этот несет также мутацию 13~, которая предотвращает лизис и
способствует накоплению больших количеств отростков. Для получения