Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
5. 0,2 мл смеси фагов добавьте к 0,2 мл суспензии клеток и проведите
адсорбцию в течение 15 мин при 37°С.
6. Разведите в 104 раз в бульоне LB (но не TYM), предварительно прогретом
до 37°С, и инкубируйте в течение 90 мин. После этого добавьте 2 капли
хлороформа.
7. Оттитруйте при условиях, которые пермиссивны для обоих родительских
фагов (чтобы определить полный титр потомства), и при условиях,
непермиссивных ни для одного из фа-гов-родителей (чтобы определить титр
рекомбинатов). Частота рекомбинации= (2Хтитр в непермиссивных условиях):
(полный титр потомства).
II. Комплементационный тест по размножению фага
1. Вырастите ночную культуру хозяина, непермиссивного для мутантного
фага. Следуйте затем этапам 1-6 стандартного скрещивания, следя за тем,
чтобы во время этапов 5 и 6 поддерживались непермиссивные условия.
2. Определите полный титр потомства на пермиссивной клетке-хозяине в
пермиссивных условиях.
III. Спот-тест на комплементацию мутантов фага (7, или Р22)
Можно быстро проверить попарно мутантов фага на комплементацию, проведя
спот-тест на чашках, засеянных непермис-сивной клеткой-хозяином. Удобно
проводить адсорбцию одного из фагов, тестируемых на комплементацию,-на
непермиссивных клетках в верхнем агаре, дать агару застыть на чашке, а
затем сверху нанести капли другого фага (фагов). Достоверность спот-теста
сильно возрастает, если по очереди адсорбировать на клетках каждый из
исследуемых мутантов, так что для каждой пары мутантов проводят
реципрокные пары тестов. Часто бывает полезно тестировать несколько
разведений каждого фага.
1. Вырастите ночную культуру непермиссивной клетки-хозяина в бульоне LB.
2. Разведите клетки '/so в среде TYM (в случае фага 7,) или LB (в случае
фага Р22) и подрастите культуру до плотности не выше 2-10s клетка/мл.
10. Тесты на рекомбинацию и комплементацию фага in vivo
79
3. К 0,2 мл клеток добавьте 107-108 частиц того фага, который будете
тестировать. Добавьте 2,5 мл расплавленного верхнего агара для фага X и
высейте на чашку для фага X. Предварительная адсорбция необязательна. В
качестве контроля приготовьте также чашку с бактериальным газоном без
фага.
4. После того как агар затвердеет (примерно через 10 мин), нанесите
стерильным капилляром капли объемом около 20-¦ 50 мкл различных
препаратов фага, которые должны тестироваться.
Лучшие результаты получаются при использовании ряда разведений каждого
препарата. Разведения 10-2, 10~3 и 10-4 препаратов фага с титром около
1010 фаг/мл перекрывают нужный диапазон. На каждой чашке используйте в
качестве контролей фаг дикого типа. Другим контролем на каждой чашке
служит фаг, адсорбированный на клетках газона.
5. Инкубируйте в течение ночи при 37°С (или при более высокой
температуре, если в тесте участвует температурочувствительный мутант).
Комплементация произошла, если даже при высоких разведениях есть пятно
лизиса, кроме, конечно, того пятна, которое имеется и в соответствующем
контроле. В высокой концентрации (низком разведении) фаг иногда может
убивать и такие клетки, на которых он не может развиваться. От такого
типа неразберихи могут уберечь лишь контроли. Всегда полезно использовать
несколько разведений.
Результаты спот-теста являются лишь ориентиром. В большинстве случаев,
чтобы подтвердить наличие комплементации, на самом деле необходимо
следить за размножением фага после совместного заражения клеток в жидкой
культуре.
Обсуждение
I. 1. Для скрещивания два фага с разными генотипами адсорбируют на
одной и той же пермиссивной бактерии-хозяине. При этом можно использовать
любые клетки, лишь бы у них не была повреждена система рекомбинации.
Штамм С600 содержит supE, а штамм BNN45 содержит и супрессор supE, и
супрессор supF и, кроме того, является hsdR- hsdM+. Поэтому в последней
клетке-хозяине можно проводить скрещивание амбер-мутантов немоди-
фицированного фага.
2. По-видимому, рекомбинация выше в экспоненциально растущих клетках.
Усилить рекомбинацию можно также, облучив клетки низкими дозами
ультрафиолета до того, как будет проведено скрещивание фагов.
80
Раздел II. Методики
3. Концентрирование клеток обеспечивает хорошую адсорбцию фага.
4. (Этапы 4 и 5); цель состоит либо в определении частоты рекомбинации,
либо' в создании рекомбинантного штамма. И в том и в другом случае
используется одна и та же методика. В обоих случаях очень важно, чтобы
условия были как можно более пермиссивными. Искажения при скрещиваниях,
обусловленные селекцией, могут легко привести к невозможности
интерпретировать полученные результаты или к слишком низкой частоте
появления искомых рекомбинатов. Очень важным фактором является
множественность заражения. Она должна быть достаточно высокой, чтобы
каждую клетку заразило примерно одинаковое число того и другого фага, но
не настолько высокой, чтобы препятствовать размножению фага. Обычно
используют множественность заражения от пяти до семи фагов каждого из
родительских типов на клетку. Рекомендуется определять титры фагов за
