Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
insertion of a drug-resistance element carrying an inverted repetition,
j. Mol. Biol., 97, 561.
Методика 6
Отбор мутантов Tets среди штаммов, несущих элемент Тп 10
1. Вырастите в бульоне LB ночную культуру штамма, несущего транспозон
Тп10.
2. Разведите культуру и высейте ее с селективной средой Бох-нера~106
клеток.
3. Инкубируйте чашки при 37°С.
4. Отберите колонии уколом и рассейте их до отдельных колоний.
5. Проверьте на устойчивость к тетрациклину.
7. Выявление Я с функционирующим геном $-лактамазы
71
Обсуждение
При работе со штаммами, несущими элемент Тп 10, часто бывает полезно
уметь отбирать мутантов, утративших устойчивость к тетрациклину. Такая
утрата транспозона дает возможность повторно использовать Тп 10 при
конструировании штаммов и, кроме того, позволяет проводить отбор делеций
и инверсий, индуцированных Тп10. Описанная здесь методика такого отбора
разработана Бохнером и др. (Bochner et al., 1980). Детальные основы
такого отбора не вполне ясны, но известно следующее:
1. При автоклавировании хлортетрациклин превращается в соединение,
индуцирующее функцию устойчивости, присущую Тп 10. Это индуцирующее
соединение не токсично для клеток.
2. Рост клеток, у которых индуцирована устойчивость к тетрациклину,
подавляется фузаровой и хинальдиновой кислотами. Те клетки, которые в
результате мутации утратили детерминанты устойчивости к тетрациклину,
становятся устойчивыми к фузаровой или хинальдиновой кислоте.
3. Фузаровая и хинальдиновая кислоты представляют собой
липидорастворимые вещества, способные хелатировать двухвалентные катионы.
4. Если в среду добавлено железо или марганец, то хинальдиновая и
фузаровая кислоты уже не оказывают ингибирующего действия.
5. Важно, чтобы высевались небольшие количества клеток (<10б на чашку).
Литература
Bochner В., Huang Н.-С., Schieven G., Ames В. N.. 1980. Positive
selections for loss of tetracycline resistance, J. Bacteriol., 143, 926.
Методика 7
Выявление фага Я с функционирующим геном р-лактамазы на чашках Red
Эта методика позволяет визуально выявлять фаги с функционирующим геном р-
лактамазы. Ее можно использовать для идентификации таких производных фага
Катр, у которых мута-
72
Раздел II. Методики
ция приводит к дефекту по р-лактамазе. Суть этой методики обсуждается
ниже.
1. Накануне эксперимента разлейте чашки Red (приложение 1).
2. Вырастите культуры DB6430 и DB4383 в бульоне TYM при 37°С до плотности
3-108 клетка/мл. Перед использованием не храните их очень долго (даже во
льду).
3. Разведите фаг так, чтобы при высеве на чашку 0,1 мл разведения
образовалось 40-100 бляшек. Добавьте 0,1 мл такого разведения фага к 0,1
мл культуры DB4383 и инкубируйте смесь в течение 20 мин при комнатной
температуре.
4. К этой смеси добавьте 0,1 мл культуры >DB6430, смешайте с 2,5 мл
верхнего агара для фага X и вылейте на чашку Red. Инкубируйте при 34°С.
5. Через 25 ч после высева поглядите на чашки и затем проделывайте это
каждые несколько часов.
6. Важно проверить эту методику, высеяв контрольные фаги (просто Xamp, X
без атр и смесь этих фагов).
Обсуждение
В этой методике используется тот факт, что, когда р-лакта-маза выделяется
в среду, она разрушает ампициллин и спасает оказавшиеся рядом
чувствительные gal+-клетки. Такие спасенные gal+-клетки сбраживают
галактозу, восстанавливают тетразолий и образуют вокруг бляшки красный
ореол. Для обеспечения роста фага на чашки высевают также и ^аД-клетки.
Эти ^/--клетки устойчивы к ампициллину (но не выделяют р-лактамазы).
gal~-Бактерии могут выступать в роли клеток-хозяев для фага, но не
восстанавливают тетразолий (не дают красной окраски). Таким образом,
клетки gfa/~AmpR (DB4383) могут расти по всей чашке, но не дают окраски.
Клетки же gal+Amps (DB6430) растут (и дают окраску) лишь вблизи бляшки
фага X, продуцирующего р-лактамазу (Ыа+).
Важно подобрать концентрацию ампициллина на таких чашках для каждой
используемой партии этого препарата. Это должна быть та минимальная
концентрация ампициллина, при которой подавляется рост клеток DB6430 в
газоне.
3. Индукция мутаций гидроксиламином
73
Методика 8
Индукция мутаций гидроксиламином
I. Выделение мутаций в фаге или клонированном гене (например, в гене
(3-лактамазы)
1. Смешайте 0,4 мл буфера фосфат-ЭДТА (0,5 М КР04, pH 6,0, и 5 мМ ЭДТА),
0,5 мл стерильной воды, 0,8 мл раствора гид-роксиламина
(свежеприготовленный 1 М NH2OH при pH 6; 0,56мл/4М NaOH добавлено к 0,35
г NH2OH и доведено стерильной водой до 5 мл), 0.1 мл стерильного 0,2 М
MgS04 (для фага X) и 0,2 мл препарата фага (109-10й БОЕ/мл).
2. Приготовьте контрольную пробу (вместо гидроксиламина добавлена
стерильная вода).
3. Инкубируйте эти смеси при 37°С в течение 12-48 ч.
4. Периодически (примерно через каждые 6-8 ч) отбирайте пробы, разводите
их '/юо холодной средой LBSE (среда LB, содержащая 1 М NaCl и 1 мМ ЭДТА).
Через 1 ч разводите их в 2 раза средой для разведения фага X и держите на
холоду.
