Генетика бактерий - Девис Р.
Скачать (прямая ссылка):
(если необходимо добавлять больший объем
5-301
114
Раздел II. Методики
препарата, то количество ДМСО можно уменьшить или вообще не добавлять
его),
2,5 мкл 0,2 М NaP04 (pH 7,0),
7,1 мкл 7М деионизованного глиоксаля,
15,3 мкл препарата.
3. Закройте пробирку крышкой и инкубируйте в течение 60 мин при 50°С.
4. Добавьте сахарозу или глицерол, бромфеноловый синий в качестве
красителя и нанесите образец на гель.
Б. Гель
1. В качестве буфера для электрофореза используется 10 мМ NaP04 (pH 7,0).
2. Используется гель из 1-1,5%-ной агарозы или 0,5%-ной агарозы и 1,5-2%-
ного раствора полиакриламида.
3. Электрофорез проводится в течение 4-20 ч при 1 В/см.
4. Необходима рециркуляция буфера в аппарате.
5. а. Окрашивайте в растворе акридинового оранжевого с кон-
центрацией 30 мкг/мл в течение 30 мин. Отмывайте, погрузив гель на 1 ч в
1 мМ Иа3-ЭДТА.
или
б. Чтобы глиоксилирование не блокировало гибридизации нуклеиновых
кислот, проведите обратную реакцию. Для этого выдержите гель в течение 30
мин в 200 мл 50 мМ NaOH. Нейтрализуйте гель и окрасьте нуклеиновую
кислоту, поместив гель на 30 мин в 200 мл 0,2 М ацетат натрия (pH 4,0) с
бромистым этидием в концентрации 1 мкг/мл.
Отмойте гель, поместив его на 30 мин в 0,2 М ацетат натрия (pH 4,0).
6. Фотографирование.
а. Бромистый этидий: освещайте светом с длиной волны 254 нм и
фотографируйте, используя УФ-фильтр и оранжевый фильтр.
б. Акридиновый оранжевый: освещайте светом с длиной волны 254 нм и
фотографируйте, используя УФ-фильтр и желтый фильтр.
Двухцепочечная нуклеиновая кислота - флуоресценция в зеленой области
спектра при 530 нм.
Одноцепочечная нуклеиновая кислота - флуоресценция в красной области
спектра при 640 нм.
В. Приготовление глиоксаля
1. 30%-ный раствор глиоксаля (технического) в НгО соответствует
приблизительно 7 М. Глиоксаль легко окисляется, и
21. Перенос ДНК на нитроцеллюлозу или бумагу
115
продукты его окисления можно удалить с помощью ионообменной
хроматографии. Среди продуктов окисления гликолевая, глиоксиловая и
муравьиная кислоты.
2. Деионизируйте, пропуская через колонку (сделанную из пипетки на 10 мл)
с AG-501-X8 или AG-501-X8(0). На 1 мл глиоксаля нужно 0,5 мл смолы.
3. Храните в герметично закупоренных пробирках при -20°С. (Пробирки
должны быть плотно закуцорены, а воздушная прослойка - небольшой.)
Г. Стабильность глиоксаля pH <6 - стабилен
pH 7 - стабилен в течение по крайней мере 20 ч Константы скорости
разложения: pH 8,0-0,001 мин-1
pH 10-0,02 мин-1 pH 11 -0,06 мин-1
Литература
McMaster G. К-, Carmichael G. G., 1977. Analysis of single- and double-
stranded nucleic acids on polyacrylamide and agarose gels by using
glyoxal and acridine orange, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 4835.
St. John Т. (личное сообщение).
Методика 21
Перенос ДНК на нитроцеллюлозу или диазотированную бумагу
I. Перенос из агарозных гелей
А. Агарозный гель
1. Проведите электрофоретическое разделение ДНК, используя горизонтальный
аппарат и гель размера 14,5Х13,5Х Х0,8 см (150 мл). Обычно мы используем
0,7%-ную агарозу и трис-ацетатный буфер.
2. В каждую лунку длиной 0,4 см можно нанести до 5 мкг ДНК, расщепленной
рестриктирующей эндонуклеазой. Мы наносим около 1 мкг расщепленной
бактериальной ДНК-
5*
116
Раздел II. Методики
3. В буфер для электрофореза добавлен бромистый этидий (0,5 мкг/мл).
При фотографировании гель освещают коротковолновым УФ-светом.
Б. Расщепление больших молекул ДИК в геле посредством депуринизации
Если используемая ДНК получена с помощью метода быстрого выделения, то
депуринизацию проводить не нужно. По-видимому, при действии
диэтилоксидиформата и прогрева в ней образовалось столько одноцепочечных
разрывов, что стал возможным быстрый и полный ее перенос из геля. В этом
случае можно опустить этапы 1-3 и начать прямо с этапа В-1.
1. Поместите гель [размером 14,5x13,5x0,8 см (150 мл)] в лоток и добавьте
250 мл 0,25 М НС1 при комнатной температуре.
2: Периодически покачивайте в течение 15 мин. После этого слейте кислоту
и повторите этапы 1 и 2.
3. Быстро сполосните гель водой и сразу же переходите к этапу В. .
В. Денатурация щелочью
1. Добавьте 250 мл 0,5 М NaOEI и 1,5 М NaCl, осторожно покачивайте в
течение 15 мин.
2. Слейте щелочь и повторите этап В-1.
Г. Нейтрализация
1. Для переноса ДНК на нитроцеллюлозу нейтрализуйте, добавив 500 мл
раствора, содержащего 0,5 М трис-HCl
(pH 7,5) (60 г трис-основания и 30 мл концентрирован-- ной НС1 на 1 л) и
1,5 М NaCl (90 г на 1 л) при комнатной температуре. Осторожно покачивайте
в течение 30 мин.
2. Для переноса на диазотированную бумагу нейтрализуйте двумя порциями по
'250 мл 1 М ацетата натрия (pH 4,0). В каждой порции выдерживайте по 30
мин. Удалите высокую концентрацию соли, промыв гель в течение 30- 60 мин
в 0,1 М ацетате натрия (pH 4,0).
Д. Перенос на бумагу
1. На большой лист пластика или на лоток положите стопку из 12 листов
бумаги ватман ЗММ (листы размером 57x46 см нарежьте или сложите и
