Лабораторный практикум по общей технологии пищевых производств -
ISBN 5-10—002282—5
Скачать (прямая ссылка):
За единицу глюкоамилазной активности принято такое количество фермента, которое, гидролизуя растворимый крахмал при температуре 30 °С и pH 4,7 в течение 1 мин, освобождает 1 імкмоль глюкозы.
Количество глюкозы, образующееся в результате ферментативного расщепления крахмала, определяют с помощью ферментов глюкозооксидазы и пероксидазы следующим образом.
Глюкозооксидаза катализирует окисление D-глюкозы кисло-
233
родом воздуха до глюконовой кислоты. Одновременно образуется пероксид водорода в количестве, эквимолярном окисленной глюкозе.
Под действием пероксидазы пероксид водорода окисляет гексацианоферрат (II) калия (калий железистосинеродистый, желтая кровяная соль) до гексацианоферрата (III) калия, имеющего лимонно-желтый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна количеству образующейся глюкозы. Реакции идут по следующим уравнениям:
OHCh2(CHOH4)COH-T-H2O rj"°K0!^ CHsOH(CHOH)<C00H+H2Os • D-глюкоза оксидаза Глюконовая кислота
^nq»«««. 05Os+H2O 2K4[Fe(CN)e]+0,5O2+H2O—*2Ka[Fe(CN)e)+2K;OH.
Необходимые реактивы: 1) 1%-ный раствор крахмала— субстрат для анализа грибных препаратов должен иметь pH 4,7, для чего добавляют ацетатный буфер с соответствующим pH; для анализа дрожжевых препаратов требуемый pH субстрата создают добавлением фосфатного буфера с pH 5,6. 2) 1 M фосфатный буферный раствор с pH 7,5 — смешивают равные объемы KH2PO4 (136 г безводного KH2PO4 в 1 дм3 дистиллированной воды) и KOH (56 г KOH в 1 дм3 дистиллированной воды). 3) Насыщенная бензойная кислота — 2,7 г бензойной кислоты растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе на 1 дм3. 4) 0,1%-ный раствор глюкозы в бензойной кислоте. 5) Рабочий раствор вспомогательных ферментных препаратов (раствор С) — готовят смешиванием равных объемов раствора А (0,1 г гексациноферрата (II) калия растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 см3; раствор готовят непосредственно перед определением) и Б (5,6 мг глюкозооксидазы, соответствующих 500—600 ед/г ферментативной активности при активности глюкозооксидазы 10000 ед/г, растворяют в 1 M фосфатном буфере с pH 7,5 в мерной колбе на 50 см3, затем добавляют 2 мг пероксидазы. Объем доводят до метки 1 M фосфатным буфером). Полученный раствор хранят в темной склянке в холодильнике в течение 2—3 сут. 6) Раствор исследуемого ферментного препарата— готовят 0,1%-ный раствор, для чего взвешивают навеску ферментного препарата массой 0,1 г с погрешностью не более 0,0002 г, тщательно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и при необходимости фильтруют. Из основного раствора при необходимости готовят рабочий раствор фермента, разбавляя основной раствор так, чтобы в 5 см3 рабочего раствора содержалось такое количество фермента, которое
234
при гидролизе крахмала привело бы к образованию не более 60 мкг глюкозы в 1 см3 гидролизата.
Техника определения — к5 см3 испытуемого раствора ферментного препарата, нагретого до 30 °С, приливают 10 см3
1 %-ного раствора крахмала, нагретого до той же температуры, и выдерживают 10 мин в ультратермостате при 30 °С. Точно через 10 мин (по секундомеру) отбирают 1 см3 гидролизата в пробирку, помещенную в кипящую водяную баню, выдерживают
2 мин для инактивации фермента и затем охлаждают холодной водой.
Для определения содержания глюкозы в пробирку вносят по 3 см3 реактива С, раствор перемешивают и оставляют на 45 мин при комнатной температуре.
Одновременно готовят контрольную пробу на инактивиро-ванный фермент. Для этого 5 см3 раствора исследуемого ферментного препарата помещают в пробирку и нагревают 10 мин в кипящей водяной бане для инактивации фермента. Затем к раствору добавляют 10 см3 субстрата и проводят все последующие операции так же, как и при работе с опытным раствором. Кроме того, ставят контрольную пробу на реактив С. Для этого к 3 см3 реактива С приливают 1 см3 дистиллированной воды и выдерживают 45 мин.
Интенсивность окраски полученных растворов измеряют на фотоэлектрокол ори метре ФЭК-56М при светофильтре с длиной волны 400 нм в кювете с толщиной слоя раствора 1,0 см в сравнении с контрольной пробой на реактив С или на инактивиро-ванный фермент. Если величины оптических плотностей будут выше или ниже пределов, указанных на калибровочной кривой, то опыт повторяют с меньшим или большим количеством испытуемого ферментного препарата. По полученным оптическим плотностям по калибровочной кривой находят количество глюкозы, образовавшейся в процессе гидролиза.
Для построения калибровочной кривой используют стандартные растворы глюкозы, содержащие в 1 см3 50, 100 и 150 мкг глюкозы. К 1 см3 стандартного раствора глюкозы добавляют
3 см3 рабочего раствора С. Через 45 мин измеряют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре. По полученным значениям строят калибровочную кривую, откладывая по оси абсцисс количество глюкозы, по оси ординат — соответствующую оптическую плотность. Рабочая зона калибровочной кривой лежит в области 10—150 мкг.
