Лабораторный практикум по общей технологии пищевых производств -
ISBN 5-10—002282—5
Скачать (прямая ссылка):
Глкжоамилааную активность ГлА (в ед/г) определяют по формуле
ГлА= Ь-180-10 '
235
где а — количество глюкозы, образовавшейся в I см3 гидро.шзата sa счет действия фермента, мкг; b — количество фермента в 1 см3 гидролизата, г или см3; 180—молекулярная масса глюкозы (пересчет микрограммов в микромоли); 10 — время гидролиза, мни.
Запись в лабораторном журнале
Масса навески ферментного препарата для приготовления основного раствора в колбе вместимостью, ом3 (т) Количество основного раствора фермента, взятое для приготовления рабочего раствора в колбе вместимостью У см3 (п)
Количество рабочего раствора, взятое для проведения ферментативной реакции (k)
Количество ферментного препарата, находящееся в 1 см3
(mnk \ Ь= уу>.\§ I
Величина оптической плотности (D) Количество глюкозы, найденное по калибровочной кривой (а)
Глюкоамилазиая активность (ГлА) Заключение
Определение протеолитической активности ферментных препаратов. Протеолитическая активность (ПС) характеризует способность ферментов катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот. Ее выражают числом единиц протеазы в 1 г препарата.
Для характеристики ферментных препаратов по протеолитической активности в промышленности и научных исследованиях широко используются две группы методов.
В первой группе методов протеолитическую активность определяют по общему количеству продуктов, не осаждаемых три-хлоруксусной кислотой, образующихся за определенный промежуток времени при гидролизе белка (казеина, казеината натрия, гемоглобина). Анализ гидролизатов проводят интерферо-метрическим методом.
Во второй группе методов скорость ферментативной реакции гидролиза белка устанавливают по количеству образовавшихся аминокислот — тирозина и триптофана, которые определяют колориметрически с применением реактива Фолина.
Каждый из методов имеет свои недостатки и достоинства. Первая группа методов проста, имеет высокую точность, однако необходима проверка расчетных уравнений для каждого ферментного препарата из нового продуцента.
Колориметрические методы отличаются сложностью, меньшей точностью, но не требуют внесения каких-либо изменений в расчет величин активности.
г
CM3 CM3
г
мкг ед/г
236
Определение протеолитической активности модифицированным методом Ансона. Метод основан на гидролизе белка казеи-ната натрия препаратом фермента с последующей инактивацией фермента и осаждением негидролизованного белка трихлоруксус-ной кислоты (TXYК). Скорость реакции определяют по количеству образовавшегося тирозина, которое устанавливают колориметрической реакцией с фенольным реактивом Фолина. Интенсивность окраски получаемого комплексного соединения определяют на фотоэлектроколориметре. С помощью калибровочной кривой по полученным оптическим плотностям определяют количество образовавшегося тирозина и, подставляя эту величину в расчетную формулу, получают протеолитическую активность.
За единицу протеолитической активности (ПС) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 30 °С превращает в неосаждаемое TXYK состояние казеинат натрия в коли: честве, соответствующем 1 мкмоль тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг).
Активность грибных и бактериальных протеиназ определяют при следующих значениях pH: 2,5±0,2 — кислая протеиназа; 3,5±0,2 — кислая протеиназа; 7,2±0,2 — нейтральная протеиназа; 9,5±0,2 — щелочная протеиназа.
Необходимые реактивы: 0,1 M универсальный буферный раствор — готовят смешиванием равных объемов растворов А (0,1 M раствор уксусной кислоты — 5,7 см3 ледяной уксусной кислоты растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды), В (0,1 M раствор ортофосфорной кислоты — 6,45 см3 ортофосфор-ной кислоты растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды) и С (0,1 M раствор ортоборной кислоты — 6.18 см3 ортоборной кислоты растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды) и различных количеств 1 н. раствора гидроксида натрия (40 г NaOH растворяют в 1 дм3 воды), получают буферные растворы с pH от 1,8 до 12,0.
0,5 M универсальный буферный раствор — готовят смешиванием пятикратных количеств растворов А, В и С.
0,01 M универсальный буферный раствор — готовят смешиванием девяти объемов дистиллированной воды с одним объемом 0,1 M универсального буферного раствора.
0,3 M раствор TXYK — 50 г TXYK разводят дистиллированной водой в мерной колбе на 1 дм3 и фильтруют.
1 н. раствор соляной кислоты.
0,5 M раствор карбоната натрия.
0,2 н. раствор соляной кислоты.
Реактив Фолина (см. работу 5).
Приготовление растворов ферментных препаратов— 0,1 — 1,0г исследуемого препарата отвешивают с погрешностью не более 0,0002 г, тщательно растирают в стакан-
237
чике стеклянной палочкой с небольшим количеством 0,1 M универсального буферного раствора с pH, соответствующим для кислых, нейтральных или щелочных протеаз (см. выше). Затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 CM3 и доводят этим же универсальным буферным раствором объем жидкости до метки.
Приготовление субстрата (2%-ного раствора ка-зеината натрия) —2 г воздушно-сухого казеината натрия растворяют в 90 см3 0,1 M буферного раствора с pH соответственно для кислых протеиназ 3,5 (pH раствора затем доводят до 2,5 добавлением 1 н. раствора соляной кислоты) и 5,5 (для доведения pH до 5,5 также используется 1 н. раствор соляной кислоты), для нейтральных — 7,2 (доводят с помощью 1 н. раствора NaOH), для щелочных — 9,5 (также используется 1 и. раствор NaOH). Затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем до метки 0,1 M универсальным буферным раствором с соответствующим pH.
