Лабораторный практикум по общей технологии пищевых производств -
ISBN 5-10—002282—5
Скачать (прямая ссылка):
В целях сокращения времени растворения казеината натрия раствор готовят при нагревании до 70 °С при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Срок хранения 2%-ного раствора казеината натрия не более 2 сут (в холодильнике) .
Техника определения — в две пробирки наливают по 2 см3 субстрата и помещают их в ультратермостат при 30 °С. Через 10 мин в каждую пробирку приливают по 2 см3 раствора фермента, пробирки встряхивают и оставляют на 10 мин при 30 °С. Количество взятого фермента должно быть рассчитано так, чтобы присутствовал большой избыток субстрата и величина оптической плотности лежала в области 0,07—0,85 для кислых протеиназ и 0,20—0,60 — для нейтральных и щелочных протеиназ. Концентрация белка-субстрата в реакционной смеси должна быть 1%-ной. Через 10 мин в обе пробирки добавляют по 4 см3 0,3 M раствора TXYK для инактивации ферментов, осаждения белка и высокомолекулярных продуктов гидролиза. Смесь быстро перемешивают и выдерживают 20 мин при 300C для полного осаждения, а затем фильтруют через маленькие воронки с бумажными фильтрами в сухие пробирки. Из полученного прозрачного фильтрата отбирают в чистые сухие пробирки по 1 см3, добавляют по 5 см3 0,5 M раствора карбоната натрия, перемешивают и быстро при непрерывном перемешивании приливают по 1 см3 рабочего раствора реактива Фолина. Через 20 мин измеряют оптическую плотность окрашенного в. голубой цвет раствора на фотоэлектроколориметре.
Оптическую плотность растворов определяют по отношению к контрольному на фотоэлектроколориметре при длине волны; 656—670 им в кюветах с толщиной слоя раствора LQ. мм.
і
238
Одновременно готовят контрольную пробу, приливая реактивы в такой последовательности: к 2 см3 ферментного раствора того же разведения, как и в опыте, добавляют 4 см3 TXYK, выдерживают в термостате при 30 °С 10 мин, а затем вносят 2 см3 субстрата. Через 20 мин раствор фильтруют, в сухую пробирку отбирают 1 см3 фильтрата и при перемешивании вносят 5 см3 0,5 M раствора карбоната натрия и 1 см3 рабочего раствора^ реактива Фолина.
Построение калибровочной кривой — калибровочную кривую для расчета протеолитической активности строят по тирозину. Затем по полученной кривой вычисляют тирози-новый эквивалент ТЭ, т. е. ту оптическую плотность, которую бы дал 1 мкмоль тирозина в 1 см3 стандартного раствора. Этот эквивалент устанавливают для каждой партии реактива Фолина и каждого фотоэлектроколориметра. Для построения градуи-ровочной кривой готовят раствор тирозина концентрацией Ю-3 М. Для этого 181,19 мг чистого тирозина (погрешность взвешивания не более 0,0002 г) растворяют в 0,2 н. растворе соляной кислоты в мерной колбе вместимостью 1 дм3 (готовят две параллельные пробы). Этот исходный раствор используют для получения рабочих растворов, для чего в мерную колбу вместимостью 50 см3 вносят пипеткой определенное количество исходного раствора тирозина (в соответствии с табл. 35) и доводят раствор до метки 0,2 н. раствором соляной кислоты.
Таблица 35
№ раствора
Количество исходного раствора тирозина, см*
Концентрация тирозина в рабочем растворе, мкмоль/см'
1 2 3 4 5 6 7
1 2 4 5
7,5 10 15
0,02 0,04 0,08 0,10 0,15 0,20 0,30
Затем в пробирки вносят по 1 см3 раствора тирозина разной концентрации и добавляют в них при постоянном помешивании по 5 см3 0,5 M раствора карбоната натрия и 1 см3 рабочего раствора Фолина.
Контрольный опыт готовят так же, но вместо раствора тирозина берут 1 см3 дистиллированной воды. Дают реакционной жидкости постоять 20 мин при комнатной температуре и измеряют величину оптической плотности опытных растворов на фо-
і
239
.. . 0.1 0.2 0.1 массовая доля тиразина.мкмоль/смЗ
Рис. 19. Калибровочная криаая зависимость
оптической плотности растворов от массовой доли в них тирозина
тоэлектроколори метре по сравнению с контрольным при длине волны 656—670 нм в кюветах с толщиной слоя раствора 10 мм. По средним данным, полученным из двух исходных растворов тирозина, строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают, количество тирозина С (в мкмоль/см3), на оси ординат— соответствующие значения оптической плотности D. Например, в результате колоримеїрирования получены следующие величины оптических плотностей:
С, мкмоль/см3 0,02 0,04 0,08 0,10 0,15 0,20 0,30 D 0,037 0,070 0,127 0,151 0,220 0,310 0,500
Как видно по градуировочной кривой (рис. 19), раствор с содержанием 1 мкмоль тирозина в 1 см3 дает оптическую плотность 0,151. Отсюда тирозиновый эквивалент 73 = 0,151/0,1 = 1,51.
Протеолитическая активность ПС (в ед/г) вычисляют по формуле
П0~ re-io-m '
где 4—отношение объемов реакционной смеси и раствора фермента после добавления TXYK; 1000 — коэффициент перевода полученных единиц иа 1 г ферментного препарата; ТЭ — тирозиновый эквивалент, определяемый по калибровочной кривой; 10 — время гидролиза субстрата, мин; m — количество ферментного препарата, взятого иа протеолиз, мг. Запись в лабораторном журнале
Масса навески ферментного препарата (а) для приго- г товления основного раствора в колбе вместимостью V Количество основного раствора фермента, взятое для см3 приготовления рабочего раствора в колбе вместимостью V (п)
