Практикум по агрохимии - 2-е изд. - Минеев В.Г.
ISBN 5-211-04265-4
Скачать (прямая ссылка):
5. Ферроциамидный реактив готовят смешиванием в день определения двух растворов: 1%-го раствора аммония азотнокислого и 1%-го раствора [K4Fe(CN)6].
6. Стандартный раствор медной соли для калибровочной кривой: 6,092 г CuCl2 H2O растворяют в 1 дм3 воды. 1 см" раствора содержит 6,092 мг меди и соответствует 1 мг аминного азота.
Определение пуриновых оснований и нуклеиновых кислот по азоту (по Корчагину)
Метод пригоден для анализа растительных эмбриональных тканей, бактериальной массы, нуклеопротеидов. Вещества, содержащие пурино-вые основания, подвергаются гидролизу, свободные пурины осаждаются закисью меди. После сжигания осадка закиси меди определяют азот по микрокьельдалю.
379
Навеску растительного материала от 20 до 100 мг гидролизуют в течение 1 ч, в смеси кислот 10 н. муравьиной и 1 н. HCl в равных соотношениях, объем смеси 4 см3. Гидролиз ведут с обратным холодильником при температуре 105°С.
Горячий гидролизат осторожно нейтрализуют 40%-м раствором NaOH до pH 4,5 - 4,7 для максимального осаждения белков. Холодный раствор фильтруют в мерную колбочку на 15-25 CMJ.
Осадок на фильтре промывают 1,5 см3 цитратного буфера с pH 5,0, затем водой доводят объем колбы до 2/3.
В фильтрат в мерной колбочке по каплям добавляют 20 - 25%-й водный раствор танина («х.ч.» без азота). Для полного осаждения белков и полипептидов необходимо внести 6-12 капель, тщательно их перемешивая, затем довести до метки водой.
После добавления танина раствор фильтруют через сухой фильтр или центрифугируют для отделения белков.
Берут 5 CMj прозрачного фильтрата, добавляют 3 см3 цитратного буфера pH 5 Буфером доводят смесь точно до pH 5, так как пурины количественно осаждаются из раствора только при этом значении pH.
После добавления буфера пурин из раствора осаждаем, добавляя для этого 0,3 - 0,8 см3 10%-й суспензии закиси меди.
Осадок пуринов отделяют от раствора центрифугированием, затем промывают его 2-3 раза водой, Количественно переносят осадок в колбу Кьельдаля, сжигают, добавляя 3-5 см3 концентрированной серной кислоты и проводят микроопределение азота колориметрически или микроотгонкой.
Если необходимо вычислить содержание нуклеиновых кислот по азоту пуриновых оснований, то величину азота пуринов умножают на 9,12 (эта величина 100: на среднее содержание азота пуринов в нуклеиновых кислотах).
Реактивы
1. Юн. муравьиная кислота.
2. 1 н. соляная кислота.
3. 40%-й раствор NaOH.
4. Цитратный буфер - pH 5.
5. 10%-я водная суспензия закиси меди: 1.8 г глюкозы взаимодействуют с 0,5 дм3 фелинговой жидкости, выпавший темно-красный осадок закиси меди позволяет получить 25 см" суспензии. Во второй раз вместо цитратного буфера лучше внести буферную смесь следующего состава: 1 часть 20%-й ТХУ. 2 части 1 M раствора натрия лимоннокислого и 1 часть 10%-го раствора хлористого натрия. Раствор доводится до pH 5 едким натром или лимонной кислотой.
380
Раздельное определение аминокислот и полипептидов методом титрования
Аминокислоты, полипептиды и белки в основном являются амфо-терными соединениями, благодаря одновременному присутствию амино-и карбоксильных групп.
Титрование таких соединений щелочью в водно-спиртовой среде подавляет диссоциацию аминных группировок, вследствие чего нейтральные в водных растворах эти вещества приобретают кислые свойства за счет присутствия в спиртовом растворе карбоксильных групп. Карбоксильные группы могут быть оттитрованы щелочью.
Между аминокислотами и полипептидами есть характерное отличие при титровании в водно-спиртовых растворах: можно оттитровать полипептиды в 40°- или 50°-м спирте, в то же время аминокислоты титруются в 90°- и 97°-м спирте. Плотность спирта зависит от применяемого индикатора.
Данный метод позволяет определить примерно 99% аминокислот от их количества в гидролизате.
Метод пригоден для краткосрочных опытов по изучению кинетики ферментативных процессов, протекающих при действии протеиназ и пептидаз.
Переход на микрометодику позволяет снизить потребность в спирте.
Принцип метода
Определение проводят в водном растворе гидролизата белка. При титровании в 96°-м спирте получают сумму полипептидов и аминокислот, при титровании в 50°-м спирте находят содержание полипептидов. Количество аминокислот определяют по разности первого и второго титрования. Таким образом, можно дифференцировать, до известной степени, азот аминокислот и азот полипептидов. Следует учитывать, что в 50°-м спирте при титровании аминокислоты связывают только 28%-й щелочи от общего количества, необходимого для их полной нейтрализации, поэтому при расчете содержания вводится коэффициент 0,28. Параллельно ведут титрование контрольной пробы - вода, спирт, индикатор. При титровании рекомендуется применять спиртовые растворы щелочи, а не водные, как делают обычно.
Если титрование проводят по тимолфталеину, то пептиды определяют в 40°-м спирте, а аминокислоты в 90°-м. Если при определении используют фенолфталеин, то необходимо взять соответственно 50°- и 96°-й этиловый спирт.
Ход анализа
В коническую колбу на 100 см1 берут 5 см" водного раствора гидролизата белка. Прибавляют 50 см" 90°-го этанола и 3 - 4 капли тимолфталеина.
