Практикум по агрохимии - 2-е изд. - Минеев В.Г.
ISBN 5-211-04265-4
Скачать (прямая ссылка):
При анализе белков из вегетативных органов растений происходит быстрое окисление тиразиновых остатков полифенолоксидазами, попадающими в экстракт при измельчении тканей. Внешнее проявление ферментативного окисления полифенолов фиксируется по побурению экстракта. Побурение в экстракте устраняют введением в экстрагирующий раствор «защитных добавок» с восстановительными свойствами -аскорбиновую кислоту, ЭДТА и др.
Экстракцию белков проводят при помощи системы буферных растворов, которые не нарушают структуры белковых молекул. В основу экстрагентов положен трис-глициновый буферный раствор pH 8,3.
Ход анализа
Навеску свежего растительного материала массой 2 - 3 г растирают в фарфоровой ступке на холоду при t = 2-4°С с небольшим количеством промытого кварцевого песка, добавляя туда постепенно трис-буфер для равномерного растирания, первоначально 3-4 см\ а затем добавляя по 1 см3 (время растирания не должно превышать 10 мин).
Гомогенную массу количественно переносят в центрифужную пробирку, обмывают ступку и пестик раствором буфера. Буфер берут в количестве 20 - 25 CMj на одну экстракцию, гомогенат помещают в холодильник на 1 ч, для экстракции легко растворимых белков, периодически перемешивая содержимое стеклянной палочкой. Затем гомогенат центрифугируют при 15 тыс. оборотов в мин, при t - 3-4°С в течение 15 мин. Надосадочную жидкость сливают в мерные колбы на 100 см".
Для качественного анализа белков достаточно однократного извлечения их на холоде в течение указанного времени.
Для количественного определения белков экстракцию необходимо повторить еще не менее трех раз, используя то же соотношение навески и раствора и тот же режим центрифугирования. Экстракция считается законченной, если в последнем растворе белок по Лоури не обнаруживается.
Надосадочную жидкость последующих экстракций сливают в ту же мерную колбу, буфером доводят объем до метки. Раствор используют для количественного определения белка по Лоури, а также для электрофореза в полиакриламидном геле.
Для экстракции труднорастворимых белков осадок в центрифужной пробирке заливают буферным раствором С из расчета 6 см" на 1 г навески материала, перемешивают и извлекают на холоду (2-4°С) в течение часа. Суспензию центрифугируют при охлаждении 3-4°С, в течение 15 мин при 15 тыс. об./мин.
373
Экстракцию повторяют еще 2-3 раза до полного извлечения белков. Надосадочную жидкость сливают вместе в мерную колбу на 100 см", доводят соответствующим буфером до метки и используют для определения белка по Лоури или для электрофореза в полиакриламидном геле.
Расчет: % белка = 0^/100 ,
а ? н
где а - мг белка по графику; V - общий объем раствора, CMJ; Н - навеска сырого материала, г; d - см" раствора белка, взятого для окрашивания.
Приготовление растворов для экстракции белков из вегетативных органов Раствор А применяется для извлечения легкорастворимых белков из растительных объектов с малым содержанием фенолов, не содержит антиокислительных добавок (pH 8.3). 5,78 г гликоля; 1,2 г трис-оксиметиламинометана растворяют в дистиллированной воде и объем доводят до 1 дм3. Раствор Б применяется для извлечения легкорастворимых белков из растений, содержит антиокислительные добавки, pH 8,3. 5 г аскорбиновой кислоты; 1,2 г едкого натра; 1 г трилона Б (двунатриевая соль этилендиамин тетрауксусной кислоты); 0,5 г диэтилдитиокарбомата натрия растворяют в растворе А и доводят общий объем до 1 дм3.
Раствор С применяется для экстракции труднорастворимых белков. 10 см3 неионного детергента Тритон Х-100 растворяют в растворе А и доводят объем до 1 дм3.
Песок очищенный прокаленный. Белый речной песок просеивают через сито 4 -5 мм. Промывают в десятикратном к весу объеме водопроводной воды 5-6 раз. воду сливают. Песок заливают смесью концентрированной соляной кислоты и воды в соотношении 1:1, неоднократно перемешивают в кристаллизаторе или эксикаторе, закрывают крышкой, оставляют на сутки. Если надосадочная жидкость приобретает желтую окраску, песок после двух-трехкратной промывки водой снова заливают смесью кислоты и воды. Песок отмывают сначала водопроводной водой до исчезновения кислой реакции по индикатору, а затем дистиллированной водой, просушивают и просеивают при / = 400-5000C для удаления органических веществ. Хранят в закрытом сосуде с притертой пробкой долго, несколько лет.
Раствор растворимого крахмала. 1 г растворимого крахмала растирают в 20 см" холодной дистиллированной воды. Эту смесь вливают при помешивании в химический стакан, содержащий 80 см" горячей дистиллированной воды, кипятят 3 мин., горячий раствор фильтруют через рыхлый фильтр. Раствор хранится в холодильнике не более трех суток (1%-й раствор растворимого крахмала).
Определение анидного азота
При определении амидов необходимо обратить внимание на фиксацию растительного материала, так как эти соединения легко разлагаются под влиянием повышенной температуры и под влиянием органических кислот растений. Растения с большим содержанием органических кислот необходимо фиксировать в спирте, это в основном
