Практикум по агрохимии - 2-е изд. - Минеев В.Г.
ISBN 5-211-04265-4
Скачать (прямая ссылка):
368
2) косвенно, определяя содержание азота в каждой белковой фракции. В колбы Кьельдаля берут по 50 см" соответствующей вытяжки, кроме спиртовой, упаривают на электроплитке содержимое до 10 см3 и добавляют 5 CMj концентрированной серной кислоты. Азот определяют колориметрически или отгонкой на микрокьельдале. При анализе спиртовой вытяжки содержимое мерной колбы количественно переносят в колбу Кьельдаля и сначала спирт отгоняют на водяной бане, затем добавляют 5-7 см3 концентрированной серной кислоты и озоляют на электроплитке.
Окрашивание растворов белка по Лоури проводится в трехкратной повторности. 1 см3 исследуемого раствора помещают в пробирку, приливают 5 см3 щелочного раствора медного купороса - раствора «С». Раствор в пробирке энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. В каждую пробирку добавляют по 0,5 см3 реактива Фолина и оставляют стоять 30 мин для развития окраски. При наличии белка желтая окраска раствора постепенно переходит в синюю. Интенсивность окраски измеряют на фотоколориметре с красным светофильтром или на спектрофотометре при 750 нм. Калибровочную кривую строят, используя сывороточный альбумин или препараты белка, близкие по свойствам к анализируемым.
a ?V-100
Расчет результатов: % белка = -гггг- .
r J н-1000 в
где а - мг белка по графику; V - суммарный объем раствора, CMJ;
в - объем раствора для окрашивания, см3; н - навеска вещества в г,
1000 - перевод мг в г.
Построение калибровочной кривой
1. 250 мг чистого белка (сывороточного у-глобулина, кристаллического альбумина) растворяют в 250 см3 0,1%-го NaOH. 1 см" такого раствора содержит 1 мг белка.
2. В мерные колбы на 50 см" приливают последовательно 5, 10. 15, 20...... 40 см"
раствора, доводят водой до метки.
3. Для окрашивания из каждой колбы берут 1 см" раствора, что соответствует 0.1: 0.2. .... 0,8 мг белка в 1 см". По данным колориметрирования вычерчивают калибровочную кривую.
Реактивы
1. Раствор «С» получают путем добавления 1 см" раствора «А» к 50 см" 2%-го раствора «В».
Щелочной раствор медного купороса: 2 г калия или натрия виннокислого растворяют в 100 см" воды. 1 г медного купороса растворяют в 100 см" воды. Перед определением белка растворы смешивают в равных объемах. Получаем раствор «А».
2 г Na2CO-, растворяют не в воде, а в 0.1 н растворе NaOH и доводят объем водой до 100 см". Получаем раствор «В».
369
2. Реактив Фолина: в круглодонную колбу (объемом 2 дм3) вносят 100 г воль-фрамата натрия (Na2WO4 " 2H2O), 25 г молибдата натрия (Na2MoO4 • 2H2O) и 700 см" дистиллированной воды. К раствору добавляют 50 см3 85%-й фосфорной кислоты, 100 см3 концентрированной соляной кислоты (d = 1,19) и кипятят при слабом и равномерном кипении с обратным холодильником в течение 10 ч. Далее прибавляют 150 г лития сернокислого Li2SO4, 50 см3 воды и несколько (3 -5) капель брома. Кипятят осторожно, без холодильника под тягой, 15 мин для удаления избытка брома. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят водой объем до 1 дм3, хорошо перемешивают и фильтруют. Полученный реактив зеленоватого цвета хранят в темной склянке в холодильнике при t« 12°С и перед употреблением разбавляют дистиллированной водой в два раза. Хранить реактив можно длительное время. При «старении» реактива Фолина интенсивность зеленоватой окраски увеличивается. Его можно регенерировать, добавив несколько капель брома. Избыток брома удаляют кипячением в течение 10-20 мин, а раствор доливают водой до исходного объема. Концентрация кислоты в реактиве Фолина должна быть 1 млэкв. Для определения концентрации кислоты берут 2 см3 реактива, разводят в 10 раз дистиллированной водой и титруют 0,1 н. раствором щелочи по фенелфталеину. При концентрации кислоты выше указанной в раствор Фолина добавляют воду. Примечание. Интенсивность окраски белка по Лоури устойчиво сохраняется при наличии в растворе ряда веществ в концентрации не превышающей указанную: этиловый спирт, эфир - 5%-й, ацетон - 0,5%-й, вольфрамат, сульфат, нитрит натрия - 1%-ые, сульфат цинка, сульфат аммония - 0,1%-ые, мочевина и нейтрализованная трихлоруксусная кислота - 0,5%-ые. Фосфатные буферы в концентрации выше 0,1 M вызывают появление осадка. Не рекомендуется определение данным методом растительных объектов с высоким содержанием фенолов и флавоноидов, т.к. они образуют аналогичную окраску с реактивом. Для удаления фенольных соединений необходима обработка материала охлажденным ацетоном.
Получение препаратов белков из фракций
Фракционный анализ белков может быть использован не только для количественного учета их, но и для определения аминокислотного состава каждой фракции. Для этого необходимо белки из растворов осадить, выделить и очистить. Осаждение белков проводится в кислой среде при нагревании; для выделения используют теплые щелочные растворы, в которых большинство белков хорошо растворяется. Очистку белков проводят последовательно ацетоном, спиртом, эфиром, высушивают и используют для последующих определений на содержание аминокислот.
Ход анализа
