Практикум по агрохимии - 2-е изд. - Минеев В.Г.
ISBN 5-211-04265-4
Скачать (прямая ссылка):
Для получения препарата белка из соответствующих фракций вытяжки водную, солевую или щелочную переносят в стаканы емкостью 700 - 800 см3 и подкисляют 10%-м раствором уксусной кислоты до pH 4,4 - 4,5. Реакцию экстракта проверяют индикаторной бумагой. При избытке уксусной кислоты в растворе добавляют 10%-ю щелочь NaOH.
370
Стаканы на водяной бане нагревают до 700C и выдерживают до полного осаждения белков. Белки отделяют центрифугированием. Осадок белка в центрифужных пробирках промывают 1%-м раствором уксусной кислоты.
Для лучшей очистки полученный белок переосаждают из щелочного раствора, так промытый осадок в центрифужной пробирке заливают на 1/2 объема 0,2 н. NaOH (t = 40 - 500C) и растворяют белок, перемешивая стеклянной палочкой с оплавленным концом. Содержимое пробирки количественно переносят в химический стакан, ополаскивая пробирку теплым раствором щелочи. Стакан с раствором нагревают на водяной бане до t = 500C и выдерживают до полного растворения белка.
Нерастворимый осадок, представленный в основном клетчаткой, отделяют от раствора центрифугированием. Проводят переосаждение белков, для этого в раствор белка вливают 50%-й раствор трихлоруксусной кислоты, в таком количестве, чтобы ее конечная концентрация в растворе составила 5%.
Осажденные белки отделяют на центрифуге и многократно промывают, сначала 5-6 раз ацетоном, затем 1-2 раза горячим этиловым спиртом и подсушивают, обрабатывая осадок белков 2-3 раза эфиром.
Промывные жидкости отделяют центрифугированием в следующем режиме 4-5 тыс. об., 15 мин, t = +3-4°С, при открытой крышке центрифуги.
Полученные препараты белков - порошки белого или светлосерого цвета. Их досушивают сначала под тягой, а затем в эксикаторе и используют для проведения анализов, в том числе для количественного и качественного определения аминокислот.
? Препараты должны содержать 14 - 18% азота, меньшее содержание против указанного свидетельствует о недостаточно надежной очистке.
Ускоренный метод определения белка в вегетативных органах
Ход анализа
При определении белка в вегетативных органах навеску свежего растительного материала 1 г растирают в фарфоровой ступке, добавляя 5 - 7 CMj кипящей дистиллированной воды. Для лучшего измельчения материала добавляют немного кварцевого песка или поступают так: навеску помещают в сухую ступку, заливают небольшим количеством жидкого азота, хрупкие ткани растирают в порошок, а затем добавляют воду.
Гомогенат количественно переносят в центрифужные пробирки, доводя объем до 10 - 12 см3. Для осаждения белков добавляют 8%-й ТХУ в таком же объеме, перемешивают и центрифугируют. Осадок в пробирке дважды промывают 2,5%-м раствором ТХУ, используя стеклянную
371
палочку, и снова центрифугируют, надосадочную жидкость сливают по возможности полно.
Осадок белка в пробирке растворяют в щелочи, для этого приливают 5 см3 1 н NaOH, растирают стеклянной палочкой и разбавляют раствор водой до 0,1 н. концентрации по щелочи. Количество воды можно рассчитать по контрольной пробирке без осадка. Далее раствор фильтруют через бумажный или стеклянный фильтр для отделения клетчатки, песка и других примесей.
Объем фильтрата в мерных пробирках доводят до определенного объема 0,1 н. раствором NaOH. Белок определяют в фильтрате по Лоури. При высоком содержании белка в навеске готовят разведение, используя для этого 0,1 н. раствор NaOH.
При анализе тканей и препаратов, содержащих хлорофилл, необходимо обесцветить осадок белка, так как его производные, образующиеся в щелочной среде, мешают колориметрированию. Для этого в пробирку к осадку промытого белка добавляют 4-5 см3 85%-го ацетона или смеси ацетон-спирт в соотношении 2:1, перемешивая стеклянной палочкой. Смывают осадок с палочки небольшим объемом того же раствора.
Для экстракции пигментов оставляют пробирки на 15-20 мин. Затем содержимое пробирки центрифугируют, при этом пигменты переходят в раствор, а белковый осадок обесцвечивается. Окрашенный растворитель отбрасывают, сливая по возможности полно. Остатки растворителя можно упаривать под тягой, небольшие количества спирта и ацетона не мешают определению.
Осадок белка растворяют 1 н. раствором NaOH. Если он плотный и плохо растворяется, увеличивают прилитый объем щелочи и слегка нагревают пробирки в кипящей водяной бане 10 - 15 мин. Перед фильтрованием доводят концентрацию щелочи до 0,1 ни фильтруют через бумажный или стеклянный фильтр в мерную колбу или пробирку. Объем фильтрата доводят до метки 0,1 н. щелочью.
Количественное определение и экстракция растворимых белков из вегетативных органов
Оценка функциональной активности растений в значительной степени определяется количественным и качественным составом белков в различных органах и частях клетки, а также на разных фазах органогенеза. Методы фракционирования белков из вегетативных органов имеют свои особенности и отличаются от методов, применяемых для выделения белков из зерна. При анализе вегетативных органов следует учитывать, что они содержат в основном лабильные,
372
высокоактивные белки, большое количество ферментов и интенсивно окрашенных пигментов.
