Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Принципиальным было открытие того, что последовательности ДНК, ковалентно не связанные с геном, придающим клеткам селективный фенотип (селективным геном), переносятся (при обработке
клеток смесью ДНК) и обнаруживаются совместно с ним в клетках трансформантиых клонов — это явление получило название котранс-формации [10]. Возможность котрансформации означает, что при наличии соответствующих клеток-реципиентов и селективного гена в клетки можно ввести любые иные векторные ДНК, отбирая генетически трансформированные клетки по способности (обусловленной экспрессией селективного геиа) расти на селективной среде и идентифицируя среди них ^трансформированные клоны.
Для введения ДНК в соматические клетки обычно применяются методы с использованием химических агентов, защищающих ДНК от вне- и внутриклеточных нуклеаз и облегчающих проникновение ДНК в клетки, — фосфата кальция и ДЭАЭ-декстрана. При смешивании раствора ДНК с растворами, содержащими ионы кальция и фосфата, молекулы ДНК включаются в образующиеся микрокристаллы фосфата кальция; ДНК в таком комплексе значительно более устойчива к действию нуклеаз [19]. Комплекс кальцийфос-фат—ДНК сорбируется на поверхности клеток и затем в основном фагоцитируется. По характеру реакции на ингибиторы дыхания и агенты, разрушающие микротрубочки, фагоцитоз кальцийфосфат-иого преципитата ДНК напоминает так называемый опосредованный рецепторами фагоцитоз [19, 20]. Если в эндоцитозе преципитата участвуют специфические рецепторы, то получает естественное объяснение жесткая зависимость эффективности проникновения комплекса в клетки от условий его формирования (pH раствора, концентрация ДНК), поскольку структура микрокристаллов фосфата кальция должна, очевидно, зависеть от условий их образования. В то же время зависимость проникновения кальцийфосфатного преципитата ДНК от узнавания его специфическими рецепторами клеточной поверхности указывает иа необходимость индивидуального подбора условий образования этого комплекса, поскольку набор рецепторов и их свойств может изменяться от одной линии клеток к другой [21, 22].
Обработка клеток ДНК в присутствии ДЭАЭ-декстрана столь же, а иногда и более эффективна, как и обработка кальцийфосфатным преципитатом ДНК в случае временной экспрессии чужеродных генов, но по неизвестным причинам выход генетически трансформированных клеток существенно ниже в первом случае [ Г1, 13]. Показано, что ДЭАЭ-декстран связывается с ДНК,нейтрализуя ее заряд и изменяя конформацию молекулы ДНК, что делает последнюю устойчивой к ДНКазам и нагреванию, и, кроме того, взаимодействует с мембраной клеток, стимулируя эндоцитоз, причем сам ДЭАЭ-декстран не проникает в клетки [23, 24]. Оптимальные концентрации векторной ДНК и ДЭАЭ-декстрана различаются для клеток разных линий. Как и при введении ДНК в комплексе с фосфатом кальция, обработка клеток мембранотропными агентами (ДМСО, глицерином или ПЭГ [25]) или изменение иных условий (например, обработка клеток в суспензии, а не в монослое [13, 26] или культивирование их в атмосфере с 2 %, а не с 5—10 % СОг [27]) может повысить эффективность введения чужеродных генов в соматические клетки.
Довольно часто для введения клонированных фрагментов ДНК :используют метод слияния под действием ПЭГ соматических клеток с протопластами бактерий, несущих соответствующие векторные ДНК [28—32]. Метод не требует выделения и очистки векторной ДНК, что может быть существенным при введении в соматические клетки интронированных генов большого размера. Кроме того, использование данного метода облегчает анализ клонотек кДНК эукариотных генов в экспрессируемых в соматических клетках векторах. Сообщалось, что в оптимальных условиях частота генетической трансформации клеток первичных эксплантатов человека может быть даже в 10—20 раз выше при слиянии с протопластами Escherichia coli, чем при обработке клеток кальцийфосфатным преципитатом ДНК [33]. Механизмы слияния протопластов бактерий с соматическими клетками (очевидно, аналогичные таковым при слиянии под действием ПЭГ клеток и микроклеток), как и возможные эффекты и роль встраивающейся в мембрану клеток бактериальной мембраны и проникающей в клетки бактериальной ДНК, детально не исследованы.
Требования к клеточным культурам
Безусловным требованием является отсутствие микоплазменной контаминации, не говоря уже о загрязнении культур другими микроорганизмами. В таблице представлены полученные нами данные по генетической трансформации соматических клеток различной видовой принадлежности. Все указанные линии клеток могут быть получены из Всесоюзной коллекции клеточных культур. Условия культивирования должны быть наиболее благоприятными. В частности, для генетической трансформации и селекции генетически трансформированных клеток используют, как правило, ростовую среду с СЭК, хотя в своей работе мы трансформировали и отбирали на среде МКГАТ генетически трансформированные клетки человека линии HeLa, культивируя их и на среде с СКРС. Ростовые среды могут быть, по-видимому, использованы любые; однако следует избегать сред, содержащих большое количество СаСЬ (например, RPMI).
