Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
1.5 мл кальцийфосфатного преципитата ДНК, поэтому готовим 0.75 мл раствора ДНК в 0.25 М растворе CaCU.
а) Вариант без ДНК-носителя (в мкл): раствор векторной ДНК (с концентрацией 0.2 мкг/мкл) — 150, НгО — 390, 10 %-ный раствор СаСЬ — 210..
б) Вариант с ДНК-носителем (в мкл): раствор векторной ДНК (с концентрацией 0.2 мкг/мкл) — 25, раствор ДНК-носителя (с концентрацией 1 мг/мл) —25, НгО — 490, 10 %-ный раствор СаСЬ — 210.
После приготовления раствор ДНК в 0.25 М растворе СаСЬ по каплям и при перемешивании добавить к равному объему (750 мкл) 2-кратного буфера А. Инкубировать 40—60 мин при 4 °С (в сосуде со льдом) для формирования преципитата.
3. Тщательно слить среду из флакона с клетками и прилить каль-цийфосфатный преципитат ДНК- Инкубировать 40—60 мин при 37 °С. Добавить около 7 объемов (по отношению к объему преципитата) ростовой среды с 2 % СЭК (10 мл на флакон с 1.5 мл преципитата).
4. Спустя 4—10 ч заменить среду на ростовую среду с 10 % СЭК. В этот момент клетки могут быть обработаны для повышения эффективности трансформации 15 %-ными растворами глицерина или ДМСО: слить среду с 2 % СЭК, промыть ростовой средой без сыворотки и прилить 10 мл раствора глицерина или ДМСО. Инкубировать от 30 с до нескольких минут при комнатной температуре (в зависимости от линии клеток). Слить раствор глицерина (или ДМСО), промыть клетки 2 раза ростовой средой по 10 мл, добавить ростовую среду с 10 % СЭК.
5. На следующие сутки рассеять клетки на чашки Петри (по 1 • 106—2 • 106 клеток на чашку диаметром 9 см для большинства систем «ген-—селективная среда») на ростовую среду с 10 % СЭК.
6. Спустя 5—6 ч после рассева или на следующие сутки сменить ростову^ среду на селективную.
Хотя для трансформации клеток кальцийфосфатным преципитатом ДНК мы с успехом использовали векторные (плазмидные) ДНК, выделенные из клеток Е. coli как щелочным методом (после 2—
3 переосаждений этанолом), так и методом осветленного лизата с последующим центрифугированием в равновесном градиенте CsCb с бромистым этидием (методы выделения векторных ДНК — см. [35]), последний способ предпочтительней. При использовании некоторых препаратов плазмидных ДНК, полученных щелочным методом, клетки могут открепляться от подложки и сползать в среду в момент о<%аботки кальцийфосфатным преципитатом ДНК- В этом случае клетки после обработки преципитатом следует осадить, промыть ростовой средой (без антибиотиков) и, ресуспензировав в ростовой среде с СЭК, поместить во флакон, где они, как правило, хорошо вновь прикрепляются к подложке. Если задача эксперимента заключается в получении количественных данных о частоте и эффективности генетической трансформации клеток, необходимо использовать плазмидные ДНК, дважды отцентрифугированные в градиенте CsCl2 с бромистым этидием. При этом необходимо проконтролировать, каково» содержание суперкольцевых молекул ДНК в полученных препаратах и, если оно различается, линеаризовать плазмидные ДНК с помощью соответствующих рестриктаз (эффективность трансформации с линейными молекулами плазмидной ДНК в 2—
10 раз выше, чем с суперкольцевыми молекулами ДНК).
При трансформации клеток китайского хомячка клона А238 мы культивируем клетки в течение 2—3 пассажей на ростовой среде, содержащей 500 мкг/мл линкомицина, 200 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл тилоцина, рассеивая их за 18 ч до трансформации на среду без антибиотиков [21, 36]. Такая предобработка повышает частоту трансформации клеток клона А238 геном ТК ВПГ1 в 10 раз. Сообщалось о повышении частоты трансформации клеток после аналогичной предобработки антибиотиками полиэнового ряда — амфо-терицином В, нистатином и др. [37].
Время обработки клеток глицерином (или ДМСО) существенно различается для клеток разных линий (в частности, для клеток линии HeLa оптимальное время обработки 15 %-ным раствором глицерина составляет 30 с, а для клеток мыши линий С127 и N1H3T3 — 120 с.) Кроме того, частота и эффективность генетический трансформации клеток китайского хомячка линий А238 и DCJX11 и клеток мыши некоторых линий не повышается, а даже понижается при обработке клеток указанными агентами. Обработка клеток зеленой мартышки линии Vero 15 %-ным раствором глицерина приводит к отслоению клеток от подложки и гибели; в то же время предобработка этих клеток глицерином (до введения ДНК) повышает эффективность проникновения ДНК в клетки [38].
Обработка клеток ДНК
в присутствии ДЭАЭ-декстрана
Составы растворов, используемых при введении в клетки комплекса ДНК—ДЭАЭ-декстрана,приводятся ниже ([34] с модификациями).
Буфер Д (в г на 1 л готового раствора): NaCl — 8, КС1 — 0.4, Na2HP04 • 2Н20 — 0.125, Трис — 3, СаСЬ — 0.1, MgCl2 • 6Н20— 0.1, D-глюкоза— 1. Растворить в 800 мл Н20, проверить pH — он должен быть равен 7.4, в противном случае довести pH до 7.4 (NaOH или НС1), стерилизовать фильтрованием. Раствор стабилен в течение года при 4 °С.
1-ый раствор ДЭАЭ-декстрана (100 мг/мл, запасной): 2 г ДЭАЭ-декстрана растворить в 20 мл буфера Д (в течение ночи при 4 °С), простерилизовать фильтрованием. Раствор стабилен при 4 °С в течение года.
