Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Для приготовления среды МКГАС в среду не добавляется тими-дин, а вместо аминоптерина добавляется 0.5 мл 1000-кратного раствора азасерина. Среда МКГАС предложена Графом с соавторами [44]. Поданным авторов (№по нашим неопубликованным наблюдениям), скорость роста и максимально достижимая плотность в монослое клеток трансформантных клонов, экспрессирующих ген КГФРТ и отобранных на среде МКГАТ, на этой среде существенно ниже, чем эти же характеристики клеток-реципиентов на неселективной среде. Ростовые характеристики клеток трансформантных клонов не изменяются и при удалении из среды микофенольной кислоты и ксантина по крайней мере на протяжении 5—10 клеточных поколений — срока, необходимого для размножения клеток клонов с целью их замораживания. Все это затрудняет работу с клетками на среде МКГАТ. По мнению авторов, среда МКГАС свободна ©т указанных недостатков; нами, однако, она не использовалась.
При селекции клеток среда МК.ГАТ (МКГАС) меняется 1 раз в 3—4 сут.
Среда для селекции клеток, трансформированных геном ДГФР.
В дефектных по ДГФР (ключевому ферменту одноуглеродного метаболизма) клетках не осуществляется биосинтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов de novo (поэтому ДГФР_-клетки культивируют в присутствии гипоксантина и тимидина). При отсутствии в среде нуклеотидов и оснований (гипоксантина и тимидина) могут выжить только клетки, экспрессирующие чужеродный ген ДГФР (или дГФР+-клетки-ревертанты). В присутствии в среде метотрексата (аналога фолиевой кислоты), стехиометрически и необратимо связывающегося с ДГФР, из популяции ДГФР+-клеток генетически трансформированных клонов могут быть отобраны клетки с увеличенным числом копий гена ДГФР (и увеличенным числом копий котранс-формированных генов) [45—48].
Селективная среда состоит из ростовой среды без нуклеотидов и оснований нуклеотидов, в которую добавлено 10 % диализованной СЭК.
Диализованная СЭК: 1) поместить СЭК в водяную баню для тепловой инактивации (45 мин при 56°С); 2) диализные трубки прокипятить в 5 %-ном растворе бикарбоната натрия, содержащего 0.1 % версена, промыть Н20; 3) налить охлажденную СЭК (500 мл) в диализный мешок, диализовать против 20 л 0.85 %-ного раствора NaCl при 4 °С с перемешиванием; первые две смены 0.85 %-ного раствора NaCl — через 4 ч каждая, затем на ночь, на следующие сутки сменить 0.85 %-ный раствор NaCl и спустя 4 ч прекратить диализ; 4) п'ростерилизовать СЭК фильтрованием, разлить по 50 мл и хранить при —20 °С. При селекции среда с диализованной СЭК меняется 1 раз в 3—4 сут.
Среда с антибиотиком G418. Антибиотик G418 (генетицин) сходен по структуре с гентамицином, неомицином и канамицином, но в отличие от них блокирует в клетках эукариот синтез белка, связываясь, по-видимому, с вОБ-рибосомами [49]. Введение в клетки гена АГФТ (прокариотного происхождения, из транспозона Тп5) делает их устойчивыми к генетицину [50, 51, 52, 53].
100-кратный раствор генетицина: 500 мг генетицина растворить в 10 мл НгО, стерилизовать фильтрованием, хранить при —20 °С.
К ростовой среде с 10 % СЭК добавить 5 мл 100-кратного раствора генетицина. Среда при селекции меняется 1 раз в 3—5 сут; с появлением видимых колоний на чашках среда заменяется на среду без генетицина; выросшие колонии выделяются (с помощью титановых цилиндров) и размножаются до 1 • 106—10 • 106 клеток в среде без генетицина, поскольку по неизвестным причинам клетки в клональной плотности более чем в 200 раз чувствительней к генетицину.
Селекция клеток на фокусы роста или в среде с полужидким агаром, применяемая для отбора клеток, трансформированных вирусными или клеточными олс-генами, описана Т. В. Поспеловой (см. наст. сб.).
1. Подгаецкая Д. Я., Бреслер В. М., Оленов Ю. М. Действие нуклеопротеинов, выделенных из сарколизинустойчивых опухолей, на сарколизинчувствительиые опухоли // Цитология. 1962. Т. 4. № 1. С. 59—61.
2. Подгаецкая Д. Я-, Бреслер В. М., Оленов Ю. М. Биологическая активность иуклео-протеидов, выделенных из клеток сарколизинустойчивого штамма саркомы 45 // Тез. докл. VIII Международ. противоракового конгр. М., 1962. С. 126.
3. Szybalska Е. Н., Szybalski Е. Genetics of human cell lines. 4. DNA-mediated here ditable transformation of a biochemical trait // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1962. Vol. 48. P. 2026— 2034.
4. Szybalski W., Szybalska E. H., Ragni G. Genetic studies with human cell lines // Nat. Cancer Inst. Monogr. 1962. Vol. 7. P. 75—89,
5. McBride O. W., Ozer H. L. Transfer of genetic information by purified metaphase chromosomes//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1973. Vol. 70. P. 1258—1262.
6. Bacchetti S., Graham F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74. P. 1590—1594.
7. 'Maitland N. J., McDougall J. К¦ Biochemical transformation of mouse cells by fragments of herpes simplex virus DNA // Cell. 1977. Vol. 11. P. 233—241.
8. Wigler М., Silverstein S., Lee L.-S. et al. Transfer of purified herpes simplex virus thymidine kinase gene to cultured mouse cells //Cell. 1977. Vol. 11. P. 223—232.
