Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Приготовление кальцийфосфатного преципитата плазмидной ДНК. Растворы, используемые для формирования кальцийфосфатного преципитата с плазмидной ДНК, те же, что описаны выше. Можно отметить, что для полного растворения плазмидной ДНК в буфере Б требуется значительно меньше времени, чем для растворения тотальной. Трансформацию можно проводить как одной плазмидной ДНК, так и с носителем. В качестве носителя часто применяется коммерческий препарат ДНК из спермы лосося, ДНК из клеток той же линии, на которой проводится трансформация, или ДНК из печени животных того же вида. Важно, чтобы использовались препараты полимерной ДНК с размером фрагментов не менее нескольких десятков тысяч пар оснований.
Трансформация эмбриональных фибробластов крысы одним онкогеном. Поскольку уже показано, что одним онкогеном получить морфологическую трансформацию практически не удается и отбор трансформантов по «фокусам» невозможен, применяется метод одновременного введения онкогенной последовательности с каким-либо доминантным селективным маркером. Такой способ введения ДНК получил название котрансформации [16, 17]. Было показано, что при 10-кратном и более избытке неселектируемого гена наблюдается котрансформация двух независимых генов в составе разных плазмид-ных векторов, т. е. в одну клетку попадают оба гена. В экспериментах такого рода наиболее часто используется плазмида с геном, обеспечивающим устойчивость к микофеноловой кислоте (Ecogpt). Это бактериальный ген, кодирующий фермент ксантин-гуанинфосфо-рибозилтрансферазу [18, 19]. Для полного подавления синтеза пуриновых нуклеотидов de novo используют микофеноловую кислоту и аминоптерин. Микофеноловая кислота ингибирует синтез пуриновых нуклеотидов, действуя на инозинмонофосфатдегидрогеназу и таким образом блокируя образование ксантинмонофосфата и гуанинмоно-фосфата.Т1осле введения в клетки эукариот гена Ecogpt клетки способны жить и пролиферировать на ксантине как единственном источнике образования гуаниновых нуклеотидов и на селективной среде, содержащей ингибиторы синтеза пуриновых нуклеотидов de novo. Кроме микофеноловой кислоты в селективную среду добавляется аминоптерин, блокирующий синтез инозинмонофосфата из аминокислот, поэтому для синтеза аденинов в селективную среду в качества предшественника добавляется гипоксантин или можно сразу вводить экзогенный аденин.
Для проведения котрансформации 3 • 105 первичных эмбриональных фибробластов крысы, на 60 мм чашку можно использовать от 0.1 до 2 мкг ДНК плазмиды, несущей ген устойчивости к микофеноловой кислоте с добавлением 10-кратного избытка ДНК плазмиды, несущей онкогенные последовательности, так чтобы в сумме общее количество ДНК на чашку не превышало 20 мкг.
Селекция котрансформантов с онкогенными последовательностями и геном устойчивости к микофеноловой кислоте. После обработки клеток плазмидной ДНК в составе кальцийфосфатного преципитата клетки культивируют в течение 3 сут на среде Дальбекко с 5 % эмбриональной сыворотки коров. После инкубации клетки снимают смесью трипсина с версеном (1 : 1) и рассевают по 105 клеток на 60 мм чашки на селективную среду, содержащую 25 мкг/мл микофеноловой кислоты, 2 мкг/мл аминоптерина, 250 мкг/мл ксантина, 15 мкг/мл гипоксантина и 10 мкг/мл тимидина (подробно о приготовлении среды ГАТ и микофеноловой кислоты см. ст. О. Л. Глебова, наст. сб.). Селективная среда также готовится на среде Дальбекко с 10 % эмбриональной сыворотки коров. Кормление клеток свежей средой с селективными агентами проводится каждые 4 сут. Устойчивые клоны можно видеть через 7—10 сут, а выделение их с помощью титановых цилиндров проводится через 14 сут на селективную среду. Клоны размножают, выделяют ДНК и гибридизацией
по методу Саузерна идентифицируют те из них, в которых находятся онкогенные последовательности, попавшие вместе с геном устойчивости к микофеноловой кислоте. Частота трансформации в этих экспериментах составляет (1.5—2)- Ю-4. После проверки стабильности Ecogpt через 30 и 75 пассажей ведения на чистой среде показано, что они могут терять признак устойчивости.
Селекция котрансформантов, устойчивых к антибиотику генети-цину G-418. Котрансформация клеток оикогенными последовательностями и геном устойчивости к генетицину проводится таким же образом, как и с геном устойчивости к микофеноловой кислоте. Ген, обеспечивающий эукариотическим клеткам устойчивость к антибиотику генетицину, выделен из бактериального транспозона Тп-5 и кодирует фермент аминогликозид — З-О-фосфотрансферазу типа 2 (АГФТ) [19]. Антибиотик весьма токсичен для клеток, однако он используется в концентрации 200—500 мкг/мл, при которой в контроле стабильные устойчивые варианты не образуются. Селективная среда готовится на среде Дальбекко с 10 % эмбриональной сыворотки коров. Время селекции на этом антибиотике зависит от плотности клеточных культур. При плотном посеве время гибели чувствительных клеток в контроле может быть более 3 нед, тогда как при оптимальной плотности посева порядка 5 • 103 клеток/см2 в опыте устойчивые клоны можно видеть уже через неделю, а выделять через 14 сут. Для анализа трансформантов на присутствие в них онкогенных последовательностей также лучше проводить выделение клонов на селективную среду, но при этом концентрацию антибиотика можно понизить до 100 мкг/мл.
