Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
to к ТК+-фенотнпу составляет (0.5—2.0) • 10—6, это учтено в таблице.
т
100-кратный раствор НОА (в мг):2 аланин — 890, глицин — 750, аспарагиновая кислота — 1330, глютаминовая кислота — 1470, про-лин — 1150, серин — 1050, аспарагин-гидрат — 1500. Аминокислоты растворить в указанной последовательности при легком нагревании, за исключением аспарагин-гидрата, который следует растворить в последнюю очередь после охлаждения раствора до комнатной температуры. Стерилизовать фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0.22 мкм (далее в тексте эта операция обозначается как стерилизация фильтрованием). Хранить (по 5 мл) при —20 °С. Раствор стабилен в этих условиях в течение года и более. На 500 мл ростовой среды добавлять 5 мл 100-кратного раствора НОА.
Для селекции генетически трансформированных клеток мы используем обычно чашки Петри диаметром 9 см (Ленинградский завод пластмасс), хотя качество подложки их неудовлетворительно (клетки садятся неравномерно, часто образуются скопления с высокой плотностью); качество подложки можно повысить, обработав чашки (дно) концентрированной H2SO4 (несколько часов) с последующим промыванием дистиллированной и деионизированной НгО (далее — просто НгО) и стерилизацией (замачиванием в 96 %-ном этаноле на ночь).
Обработка клеток
кальцийфосфатным преципитатом ДНК
Составы растворов, используемых при введении в клетки ДНК, приводятся ниже [8, 9, 34].
10-кратный буфер А (в г): HEPES — 50, NaCl — 80, КС1 — 3.7, Na2HP04 • 2Й2О—1.25, D-глюкоза — 10. Растворить компоненты в 800 мл НдО, довести pH до 7.05 1 М раствором NaOH (около 35 мл), добавить НгО до объема 1 л, простерилизовать фильтрованием, хранить при 4 °С. Раствор стабилен в течение года.
2-кратный буфер А: 40 мл 10-кратного буфера А довести НгО до 180 мл, довести pH до 7.05 1 М раствором NaOH (около 0.5 мл), добавить НгО до объема 200 мл, простерилизовать фильтрованием. Хотя раствор стабилен при 4 °С в течение года, лучше готовить его непосредственно перед использованием.
Буфер Б (в мг): Трис—121, ЭДТА • NH4 (хелаплекс)—33. Растворить компоненты в 800 мл НгО, проверить pH — он должен быть равен 9.0, в противном случае довести pH 9.0 растворами NaOH или НС1, добавить НгО до 1 л, простерилизовать фильтрованием. Раствор стабилен при 4 °С.
10 %-ный раствор СаСЬ (0.9 М): используется стерильный коммерческий фармацевтический раствор для инъекций.
15 %-ный (масса/объем) раствор глицерина: к 15 г глицерина (по массе) прибавить 85 мл ростовой среды (без сыворотки). Взвешенный глицерин стерилизуют автоклавированием (1 атм, 30 мин); после охлаждения стерильно добавляют ростовую среду. Раствор
2 Приводится количество веществ на 1 л готового раствора.
стабилен в течение нескольких недель при 4 °С, но лучше его готовить незадолго до использования.
15 %-ный раствор ДМСО: к 15 мл ДМСО прибавить 85 мл ростовой среды (без сыворотки). Компоненты стерильно смешивают непосредственно перед употреблением.
Раствор ДНК-носителя (1 мг/мл): 10 мг ДНК из спермы лосося растворить в 5 мл буфера Б (в течение ночи при 4 °С); пропустить раствор ДНК через иглу шприца диаметром 0.2 мм (или озвучить раствор ДНК); добавить 0.1 объема 3 М раствора СНзСООЫа и
2 объема охлажденного этанола, инкубировать при —20 °С; осадить ДНК центрифугированием (3000 g, 15 мин); промыть (суспензируя осадок и вновь осаждая ДНК центрифугированием) 70 %-ным и 96 %-ным этанолом (пробирка должна быть полностью заполнена спиртом); оставить на ночь осадок ДНК под этанолом для стерилизации; этанол слить в стерильных условиях, подсушить осадок ДНК и растворить ДНК в 5—7 мл стерильного буфера Б; определить концентрацию ДНК; довести концентрацию ДНК буфером Б до 1 мг/мл и разлить по стерильным пластиковым пробиркам. Можно хранить при —20 °С в течение года. Раствор стабилен и при 4 °С.
Раствор векторной ДНК: от 5 до 50 мкг плазмидной ДНК в растворе поместить в пластиковые пробирки и осадить этанолом (см. выше); оставить на ночь осадок ДНК под 96 %-ным этанолом для стерилизации (пробирки должны быть полностью заполнены спиртом); растворить в стерильных условиях подсушенный осадок ДНК в соответствующем количестве буфера Б. Обычно мы работаем с раствором векторной ДНК в концентрации 0.2 мкг/мкл.
Процедура введения ДНК может быть представлена в виде ряда последовательных этапов.
1. За 18 ч до трансформации рассеять клетки так, чтобы к моменту обработки кальцийфосфатным преципитатом ДНК они достигли 30— 50 % насыщающей плотности. Для этого мы рассеваем 1 полностью заросший флакон диаметром 8 см либо на 2 флакона (клетки человека линии HeLa, клетки зеленой мартышки линий Vero и CV1 и клетки мыши линии LMtk~), либо на 3 флакона (клетки китайского хомячка линий А238 и DUX11, а также клетки мыши линий С127 и NIH3T3). Ростовая среда на этом этапе не должна содержать антибиотиков (поскольку они образуют агрегаты с кальцийфосфатным преципитатом ДНК).
2. За 1 ч до трансформации клеток приготовить кальцийфосфат-ный преципитат ДНК. Для этого к раствору ДНК в буфере Б добавить 10 %-ный (0.9 М) раствор СаСЬ до конечной концентрации 0.25 М (конечная концентрация ДНК — 40 мкг/мл). При использовании малых количеств векторной ДНК добавить в раствор ДНК-носитель. На 1 флакон с клетками диаметром 8 см мы используем
