Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Вахтин Ю.Б. -> "Методы культивирования клеток" -> 119

Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.

Вахтин Ю.Б., Соминина А.А. Методы культивирования клеток — Л.: Наука, 1988. — 313 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikultivirovaniya1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 113 114 115 116 117 118 < 119 > 120 121 122 123 124 125 .. 171 >> Следующая

Приготовление кальцийфосфатного преципитата ДНК. ДНК, выделенная из опухолей или опухолевых клеток постоянных клеточных линий,растворяется в буфере Б в концентрации от 10 до 1000 мкг/мл (в зависимости от объема и задач эксперимента) и фрагментируется гидродинамическим способом при 2-кратном пропускании через
шприц с диаметром иглы, равным (0.2 мм. После этого ДНК осаждается двумя объемами этилового спирта в присутствии 0.1 М ацетата натрия в течение ночи при температуре —20 °С. Осадок ДНК получают центрифугированием при 12 000 g. Надосадочную жидкость тщательно удаляют, и осадок ДНК вновь растворяется в буфере Б. Для морфологической трансформации используется 10—20 мкг ДНК на 60 мм чашку, в которой находится (2—5) • 105 клеток. Общее количество преципитата готовится из расчета 0.5 мл на 60 мм чашку. Для формирования преципитата в (буфер Б, где растворена ДНК, добавляется 2 М раствор СаС12 ДО> конечной концентрации 0.25 М (можно использовать фармацевтический стерильный раствор СаСЬ, который применяется для внутривенных инъекций). К равному объему 2-кратного буфера А осторожно, по каплям, добавляется ДНК в 0.25 М растворе CaCio (пробирка постоянно встряхивается). Преципитат начинает формироваться biтечение нескольких секунд, по мере введения ДНК раствор все более опалесцирует. Если значения pH используемых растворов точно соблюдены, то образуются кальцийфосфатные гранулы очень мелкого размера. Если значение pH сдвинуто в щелочную сторону, то образуются конгломераты крупного размера, которыми трудно трансформировать клетки. При более кислых значениях pH кальцийфосфатный преципитат не образуется и трансформация клеток не идет.
Трансформация клеток. Питательную среду с клеток тщательно удаляют пастеровской пипеткой и на клеточный монослой наносится ДНК в составе кальцийфосфатнога преципитата. После этого клетки сразу же помещают в СОг-инкубатор, для того чтобы избежать колебаний рН‘,'и выдерживают в течение 1 ч. Для повышения эффективности трансфекции через 1 ч проводят либо глицериновый шок — 15 %-ным раствором глицерина в течение 2 мин при температуре 37 °С, либо 10—20 %-ным раствором ДМСО на среде Дальбекко без сыворотки в течение 2—4 мин при комнатной температуре. На 60 мм чашку добавляется по 1 мл среды с указанными агентами. После шока клетки 2—3 раза промывают бессывороточной средой, заливают среду Дальбекко с 2—5 % эмбриональной сыворотки короз и культивируют еще в течение 16—18 ч в СОг-инкубаторе. Затем клетки снимают смесью трипсина с версеном (1:1) и рассевают по 105 клеток на 60 мм пластиковые чашки в среде Дальбекко с 5 или 10 % эмбриональной сыворотки коров «Gibco». Смену среды на свежую проводят каждые 3 сут.
«Фокусы» морфологической трансформации на клетках NIH3T3 при трансформации препаратами тотальной ДНК начинают формироваться через 18—20 сут. Выглядят они как зоны многослойного роста на монослое нетрансформированных клеток. В центре «фокуса» клетки растут с очень большой плотностью и имеют округлую форму, по краям можно видеть хорошо распластанные радиально ориентированные клетки. «Фокусы» могут образовываться с разной скоростью, варьировать в размерах и по морфологии. Число фокусов на чашке подсчитывается после фиксации смесью метилового спирта с уксусной кислотой (3:1) и окрашивания клеток крисгаллвиолетом
или 1 %-ным водным раствором метиленовой сини. Выделение фокусов проводится с помощью титановых колец или цилиндров из нержа* веющей стали с внутренним диаметром от 3 до 10 мм. Ростовая среда тщательно удаляется с чашек Петри, и цилиндры с помощью силиконового клея (стерилизуется автоклавированием при 0.5 атм в течение 30 мин) приклеиваются на дно чашки так, чтобы «фокус» оказался внутри цилиндра. Затем с помощью пастеровской пипетки в цилиндр наливается смесь трипсина с версеном (1 : 1). Клетки из цилиндра после открепления пастеровской пипеткой переносятся в чашку Петри диаметром 30 мм или ячейку 24-ячеечной платы. Эффективность трансформации оценивают по частоте появления «фокусов» морфологической трансформации, возникающих при обработке 106 клеток 1 мкг ДНК- Эта частота может варьировать от 10“4 до 10 5, однако описаны случаи значительно более низкой частоты «фокусов» морфологической трансформации при переносе онкогенных последовательностей препаратами тотальной ДНК [8]. Учитывая частоту возникновения «фокусов» морфологической трансформации, можно рекомендовать в экспериментах по тестированию, трансформирующей способности тотальной ДНК из опухолевых клеток обрабатывать кальцнйфоефатным преципитатом ДНК не менее (3—4) • 106 клеток. Для анализа трансформантов лучше брать «фокусы» независимого происхождения, из разных чашек.
К числу наиболее интересных результатов, которые получены при трансформации клеток N1H3T3 препаратами тотальной ДНК из опухолей различного происхождения, можно отнести те, которые позволили обнаружить в клетках трансформирующие последовательности, не имеющие гомологии с ретровирусными трансформирующими последовательностями. Среди открытых методом ДНК-переноса онкогенов можно назвать B-lyml [9], T-lytnl [10], пей [11] и met [12], которые были не только идентифицированы методом переноса препаратами тотальной ДНК, но позднее выделены методами молекулярного клонирования.
Предыдущая << 1 .. 113 114 115 116 117 118 < 119 > 120 121 122 123 124 125 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed