Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Вахтин Ю.Б. -> "Методы культивирования клеток" -> 113

Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.

Вахтин Ю.Б., Соминина А.А. Методы культивирования клеток — Л.: Наука, 1988. — 313 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikultivirovaniya1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 171 >> Следующая

2-ой раствор ДЭАЭ-декстрана (0.5 мг/мл, рабочий): стерильно слить 0.5 мл 1-го раствора ДЭАЭ-декстрана (100 мг/мл) и 9.5 мл буфера Д. Раствор стабилен при 4 °С, но предпочтительней использовать свежеприготовленный раствор.
Раствор векторной ДНК (с концентрацией 1—2 мкг/мл): стерильный раствор векторной ДНК в буфере Б (см. выше) разбавить стерильным буфером Д до нужной концентрации (концентрация векторной ДНК в буфере Б не должна быть ниже 100 мкг/мл).
Процедура введения ДНК: 1) клетки рассеять за 18 ч до обработки ДНК на чашки Петри диаметром 6 см (1 • 105—1 • 106 клеток на чашку); 2) отсосать ростовую среду и промыть чашки 1 раз с 5 мл
буфера Д; 3) добавить по 1 мл 2-го раствора ДЭАЭ-декстрана (500 мкг/мл) на чашку; инкубировать 30 мин при комнатной температуре (или при 37 °С); 4) отсосать раствор ДЭАЭ-декстрана и добавить 0.2 мл раствора векторной ДНК в буфере Д; инкубировать чашки 30 мин при комнатной температуре (или при 37 °С); 5) отсосать раствор ДНК, промыть чашки 2 раза по 5 мл буфера Д, в этот момент кЛетки можно обработать 15 %-ными растворами глицерина, ДМСО (см. выше) или 48 %-ным раствором ПЭГ (см. ниже); после обработки (15—90 с) клетки промыть ростовой средой без сыворотки, добавить ростовую среду с 10 % СЭК; 6) на следующие сутки сменить среду; спустя еще 1—2 сут протестировать клетки на временную экспрессию чужеродного гена. При необходимости клетки могут быть рассеяны.
Слияние клеток
с бактериальными протопластами
Составы растворов, которые используются при введении ДНК в клетки с помощью слияния с протопластами, содержащими векторные ДНК с клонированными генами, приводятся ниже (по: [39, 40] с модификациями).
Среда LB (в г): бакто-пептон—10, дрожжевой экстракт — 5, NaCl — 10. Растворить в 800 мл Н20, довести pH до 7.5 2 М раствором NaOH (около 2.5 мл), довести объем до 1 л, автоклавировать (1 атм, 30 мин). Хранить при 4 °С.
Хлорамфеникол (25 мг/мл): 25 мг хлорамфеникола растворить в 1 мл 96 2^-ного (или абсолютного) этанола. Хранить при —20 °С.
Лизоцим (10 мг/мл): 10 мг лизоцима растворить в 1 мл буфера В, используется свежеприготовленный раствор.
Буфер В: сахароза — 200 г, 10-кратный буфер А — 100 мл, Н20 до общего объема 800 мл, довести pH к 7.05 1 М раствором NaOH (около 2 мл), добавить Н20 до 1 л, стерилизовать фильтрованием. Раствор стабилен при 4 °С в течение нескольких недель.
Буфер Г: сахароза — 90 г, 10-кратный буфер А— 100 мл.
0.25 М раствор ЭДТА • Na2 (pH 7.0): ЭДТА • Na2 — 93 г, растворить в 800 мл Н20, добавляя 30 %-ный раствор NaOH до pH 7.0, довести объем до 1 л, простерилизовать фильтрованием. Раствор стабилен при комнатной температуре.
1.25 М раствор СаС12: СаС12 • 2Н20— 184 г на 1 л. Стерилизовать фильтрованием. Стабилен при 4 °С.
48 %-ный раствор ПЭГ (с молекулярной массой 1000). Взвесить 24 г ПЭГ. Автоклавировать 15 мин при 1 атм. Охладить приблизительно до 60 °С. Добавить 25 мл подогретой 2-кратной ростовой среды (без сыворотки) и 1 мл Н20. Интенсивно перемешать. Раствор должен быть стабильным при комнатной температуре, не расслаиваться; если осадок образуется в первые после перемешивания минуты, подогреть на водяной бане (65—75 °С) до растворения ПЭГ. Хранить при 4 °С не более 2 нед; при —20 °С раствор стабилен в течение года.
Очистка ПЭГ. Если имеются подозрения на токсичность ПЭГ,
раствор может быть приготовлен следующим образом. 300—500 мл расплавленного при 45 °С ПЭГ поместить в водяную баню; довести pH до 7.4 с концентрированной НС1 (измеряя pH по индикаторной бумаге). Добавить и хорошо размешать 10 г смешанного анионо-катнонообменника (AG501-X8(D)—фирма «Bio-Rad», США) или смесь амберлитов IRA и IR («Serva», ФРГ), инкубировать с периодическим перемешиванием несколько часов при 45 °С. Собрать ионо-обменник фильтрованием через фильтровальную бумагу, покрытую слоем свежего ионообменника (10 г): фильтровать в вакуумную колбу с отсосом, воронку и колбу можно подогреть до 60—80 °С. Взвесить профильтрованный ПЭГ, добавить 2-кратную ростовую среду и НгО до получения 48 %-ного раствора ПЭГ. Стерилизовать фильтрованием. Условия хранения и стабильность см. выше.
Процедура слияния может быть представлена в виде следующих этапов.
1. За 1 сут до слияния клеток с протопластами инокулировать в 50 мл среды LB 4 мл ночной культуры соответствующего штамма Е. coli.
2. Спустя 2—4 ч при 37 °С при достижении оптической плотности Абоо=0.7-^0.8 (3 • 108—5 • 10 клеток/мл) добавить 50 мкл раствора хлорамфеникола (25 мг/мл), инкубировать со встряхиванием 18—20 ч при 37 °С.
3. Осадить бактериальные клетки центрифугированием (5000 об/ мин, 10 мин при 4 °С), осадок ресуспензировать в буфере В так, чтобы количество клеток составляло около 1 • Ю10 в 1 мл (обычно 2 мл).
4. На 2 мл суспензии клеток добавить 0.4 мл раствбра лизоцима в буфере В (10 мг/мл), инкубировать от 10 до 45 мин при комнатной температуре до превращения 85—90 % клеток в сферопласты (за удалением клеточной стенки необходимо проследить под фазовоконтрастным микроскопом, поскольку для разных штаммов Е. coli оптимальное время обработки лизоцимом, особенно в указанных субоптимальных по значению pH условиях, может существенно различаться; при этом чрезмерная обработка лизоцимом может повредить протопласты); эта стадия — получение сферопластов — является ключевой.
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed