Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Можно также отметить, что тотальная ДНК, которая используется для тестирования в ней трансформирующих последовательностей, должна иметь определенные размеры — порядка нескольких десятков тысяч пар оснований. Деградация ДНК до 5000 пар оснований приводит к тому, что трансформирующей способностью начинают обладать ДНК, выделенные из нормальных клеток, при этом, возможно, происходит активация онкогенных последовательностей, которые не активны в интактной высокополимерной ДНК [13].
Трансформация клеток NIH3T3
и первичных эмбриональных фибробластов крысы
клонированными оикогенными последовательностями
Кроме переноса клеточных онкогенов препаратами тотальной ДНК. в настоящее время широко используется метод генетической трансформации клонированными последовательностями онкогенов, которые включены в состав различных плазмидных векторов. Исполь-
зование этого метода позволяет осуществить принципиально новые подходы в изучении процесса канцерогенеза и его отдельных этапов. В настоящее время созданы конструкции с регулируемыми промоторами [14], с тканеспецифическими усилителями транскрипции, в частности с энхансерами иммуноглобулиновых генов [15], что позволяет решать вопросы связи отдельных признаков трансформации с количеством онкогенных продуктов и вопросы тканеспецифической экспрессии онкогенов. Введение одного онкогена в минимально трансформированные клетки грызунов (линий СЗНЮТ'/г, С-127, Rat-2, FR3T3, REF52 и др.) может приводить к образованию «фокусов» морфологической трансформации, однако это происходит не во всех случаях. В тех случаях, когда не удается индуцировать образование «фокусов», онкоген вводят вместе с каким-либо доминантным маркером устойчивости (см. ниже) и отбирают среди устойчивых клонов те, в которых гибридизацией по методу Саузерна определяется присутствие онкогенных последовательностей.
На основании результатов экспериментов по введению онкогенов в составе плазмидных векторов в первичные эмбриональные фибро-бласты крысы было впервые сформулировано представление о том, что для полной морфологической трансформации нормальных клеток требуется кооперация онкогенов по крайней мере двух типов. Один из них должен принадлежать к онкогенам «ядерного» типа, т. е. к онкогенам, продукт которых локализован в ядре и взаимодействует либо с ДНК ядра, либо с ядерным матриксом. К онкогенам «ядерного» типа относятся с-тус, c-myb, c-mil, имеющие аналоги среди ретровирусных трансформирующих последовательностей, и белок р-53 клеточного происхождения, аналогов которого у ретровирусов нет. В группу онкогенов «неядерного» типа попадает большой класс онкогенов, кодирующих тирозинзависимые протеинкиназы — c-sarc, c-fes, c-fgr, c-yes, c-ros, c-abl; группа онкогенов, кодирующая рецепторы для ростовых факторов (c-erb-B, c-fms), и сами ростовые факторы (c-sis, B-lyml); онкогены семейства c-ras, кодирующие ГТФ-связывающие белки. Выделяют также группу онкогенов, которые к настоящему времени слабо охарактеризованы — c-sci, T-lyml, c-rel.
В специальную группу можно также выделить нуклеотидные последовательности ранних и других районов аденовирусов, папова-вирусов и герпесвирусов, которые клонированы в составе различных плазмидных векторов и обладают трансформирующим действием. Эти гены способны заменять по своему функциональному действию онкогены как «ядерного», так и «неядерного» типа при тестировании их трансформирующей способности по комплементации с клеточными онкогенами при котрансформации нормальных клеток.
При введении в первичные эмбриональные фибробласты крысы онкогенов, принадлежащих к тому или другому классу, «фокуды» морфологической трансформации получить не удается. Однако введение различных онкогенов методом котрансформации с доминантными маркерами устойчивости позволяет определить, какие признаки привносятся в нормальную клетку тем или иным онкогеном. Так,
введением онкогенов «ядерного типа» в первичные эмбриональные фибробласты крысы, по-видимому, инициируются события, обеспечивающие способность клеток к неограниченной пролиферации in vitro. При введении «неядерных» онкогенов, в частности семейства ras, у нормальных клеток сразу же появляется свойство, обеспечивающее им способность клонироваться в агаре и слабо прививаться «пийе»-шлшаш. Однако такие клетки не обладают способностью длительно культивироваться in vitro и не могут давать опухоли, которые убивают животное. Лишь совместное введение онкогенов обоих типов приводит к образованию «фокусов» морфологической трансформации и вызывает в нормальных клетках полное проявление признаков, характерных для опухолевых клеток, в том числе способности неограниченно расти in vitro, клонироваться в агаре, расти на среде с низким содержанием факторов роста, прививаться синпенным животным и образовывать опухоли, которые убивают животное.
Приготовление культуры клеток из эмбрионов крысы. Культура эмбриональных фибробластов готовится из эмбрионов 12—14-суточ-ной стадии беременности по модифицированному методу [16]. Для получения клеточной суспензии эмбрионы декапитируют, удаляют внутренности, тушки измельчают ножницами в чашке Петри на кусочки размером 2—3 мм, переносят в колбу с раствором трипсина и версена (1:1) и ставят на магнитную мешалку. Раствор должен быть подогрет до 37 °С. Клетки, отделившиеся от кусочков тканей, переходят в раствор, который сливают, и вновь наливают свежую порцию трипсина с версеном. Процедуру повторяют 5—6 раз. Полученные таким образом клетки осаждают центрифугированием в стерильных центрифужных флаконах при 2000 об/мин в течение 10 мин. Клетки разбавляют до оптимальной концентрации таким образом, чтобы на 100 мм чашку получалось 1.2 • 106 клеток в объеме 8 мл среды Дальбекко с 10 % эмбриональной сыворотки коров. Культивирование в СОг-инкубаторе проводят до образования хорошего монослоя. В течение этого периода среду на свежую лучше не менять. Затем клетки рассевают для экспериментов по трансформации на 60 мм пластиковые чашки по 3 • 105 клеток. Так же как и в случае ШНЗТЗ-клеток, эксперимент должен проводиться через 16— 18 ч после посева клеток.
