Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
действующие последовательности ДНК, способные трансформировать нормальные клетки на уровне морфологии.
Наиболее широко в опытах по тестированию ДНК на присутствие в них онкогенных последовательностей используются минимально трансформированные линии грызунов, СЗНЮТ'/г, Rat-2, С-127, REF-108, REF52, FR3T3. Наиболее часто используется линия мышиных фибробластов NIH3T3, у которой хорошо выражен признак контактного ингибирования клеточной пролиферации в монослое [4]. При использовании клеток NIH3T3 и препаратов ДНК, полученных из опухолей человека и млекопитающих, было показано, что по критерию образования «фокусов» трансформирующей способностью обладают препараты ДНК из карцином мочевого пузыря, гортани, поджелудочной железы, кожи, толстого кишечника, а также рабдоми-осаркомы и различные гемопоэтические неоплазии [5]. Трансформирующие последовательности можно проводить через серии переносов и таким образом обогащать популяцию клеток последовательностями ДНК, которые отвечают за морфологическую трансформацию. При тестировании ДНК из опухолей и опухолевых постоянных клеточных линий было обнаружено, что в большей части случаев индукция «фокусов» связана с присутствием активированной формы протоонкогенов семейства ras, когда же переносили ДНК из опухолей, в которых были активированы другие типы протоонкогенов, в частности «ядерного типа», морфологическая трансформация обнаруживалась не во всех случаях. В среднем при тестировании ДНК из опухолей человека по способности вызывать «фокусы» морфологической трансформации на клетках NIH3T3, только у 20 % опухолей обнаруживаются .трансформирующие последовательности ДНК. По-види-мому, появление «фокусов» морфологической трансформации при тестировании ДНК из опухолевых клеток зависит не только от присутствия в них онкогенных последовательностей, но и от других причин. В частности, действие онкогенов может иметь рецессивный характер, и в таких случаях трудно ожидать проявления свойств трансформации на морфологическом уровне. Не исключена также тканеспецифичность в проявлении онкогенов при трансформации ДНК- Несмотря на указанные сложности, в связи с простотой и существенной информативностью метод индукции «фокусов» морфологической трансформации на клетках NIH3T3 относится к числу наиболее широко применяемых при анализе ДНК на присутствие в них онкогенных последовательностей.
Индукция «фокусов» морфологической трансформации
в клетках линии NIH3T3 препаратами тотальной ДНК
из опухолей и постоянных клеточных линий
Морфологическую трансформацию NIH3T3 клеток осуществляют с помощью различных модификаций кальцийфосфатного метода [6, 7]. Этот метод дает хорошие результаты при использовании переноса генов для большинства монослойных и некоторых суспензионных культур. Для проведения морфологической трансформации NIH3T3
клеток препаратами тотальной ДНК с помощью кальцийфосфатного преципитата необходимо выполнять несколько основных требований: 1) клетки должны быть посеяны не более чем за 16—18 ч до проведения трансформации; 2) необходимо тщательно контролировать pH используемых буферных растворов; 3) клетки не должны быть конта-минированы микоплазмой.
Культивирование клеток NIH3T3 и приготовление растворов для трансфекции. Клетки линии NIH3T3 культивируют на среде Игла в модификации Дальбекко с 10 % эмбриональной сыворотки коров «Gibco». За 16—18 ч до трансформации клетки снимают смесью 0.25 %-ного трипсина с 0.02 %-ным версеном в отношении 1 : 1 и рас-севают на 60 мм пластиковые чашки по 3 • 104 клеток/см2 и культивируют в СОг-инкубаторе до эксперимента. Среды, содержащие в составе СаС12, не могут использоваться для кальцийфосфатного переноса ДНК, так как избыток кальция вызывает уплотнение преципитата и приводит к увеличению размера гранул. Плотность клеток в момент проведения обработки их кальцийфосфатным преципитатом ДНК является важным моментом. Если используемая плотность существенно ниже указанной, клетки после обработки преципитатом могут погибать или открепляться от подложки. Если плотность клеток существенно выше указанной, эффективность трансформации снижается. Для получения кальцийфосфатного преципитата ДНК готовятся два буферных раствора и раствор СаСЬ, предпочтительно на деионизованной или Super-Q воде.
10-кратнын HEPES-буфер (Буфер А), pH 7.05: HEPES — 0.21 М, NaCl— 1.36 М, КС1 — 0.05 М, Na2HP04 • 2Н20 — 7.5 • 10“3М, декстроза (D-глюкоза) — 0.055 М. Раствор стерилизуется фильтрованием через мембранный фильтр («Millipore») тип GS с диаметром пор 0.22 мкм, доводится до значений pH 7.05 1 н. NaOH, разливается по 10 мл в стерильные флаконы и может храниться при 4 °С в течение года. Непосредственно перед экспериментом готовится 2-кратный А буфер, pH которого вновь доводится до 7.05 перед стерилизацией раствора через мембранный фильтр.
Буфер Б, pH 9.0, для растворения ДНК: Трис-HCi — 1 • 10~3 М, Na-ЭДТА — 1 • 10"4 М.
Раствор СаСЬ: готовится 2 М раствор СаСЬ, который стерилизуется фильтрованием и хранится при 4 °С.
Растворы для проведения шока: для проведения шока после кальцийфосфатного переноса ДНК можно использовать либо 10— 15 % глицерин в HEPES-буфере, pH 7.05, пропись которого приведена выше, либо 10 %-ный диметилсульфоксид на бессывороточной среде Дальбекко. Растворы готовятся непосредственно перед экспериментом и стерилизуются через мембранные фильтры («Millipore») с диаметром пор 0.22 мкм.
