Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Вахтин Ю.Б. -> "Методы культивирования клеток" -> 103

Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.

Вахтин Ю.Б., Соминина А.А. Методы культивирования клеток — Л.: Наука, 1988. — 313 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikultivirovaniya1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 97 98 99 100 101 102 < 103 > 104 105 106 107 108 109 .. 171 >> Следующая

Фрейнда
8....................50 внутрибрюшинно с полным адъюван-
том Фрейнда
4....................50 внутрибрюшинно
3....................50 внутрибрюшинно, 50 внутривенно
2....................То же
1....................Антиген не вводится
0....................Слияние
В последние годы большое внимание уделено методам иммунизации in vitro, особенно в связи с получением моноклональных антител на основе клеток человека (см. обзор: [8]). Для практического применения можно порекомендовать метод, основанный на использовании кондиционированной среды от клеток тимомы EL-4, стимулированных в течение 2 сут форболмеристатацетатом, 10 нг/мл. В такой среде содержатся интерлейкин-2, дифференцировочный В-клеточный фактор, а также ростовой В-клеточный фактор. Клетки селезенки, взятые от мышей, которым предварительно, за 2 нед, вводили внутри-
брюшинно по 50 мкг антигена, культивируют в течение 4 сут в среде, содержащей 10 % кондиционированной среды и 100 мкг/мл антигена [9], после чего проводят слияние.
В процессе иммунизации у животных определяют титр антител к данному антигену. Для этого из орбитального синуса делают забор крови. Для бустирования и дальнейшего слияния отбирают животных с максимальным титром антител.
Слияние
Источником В-лимфоцитов служит, как правило, селезенка иммунизированных животных. В редких случаях их выделяют из лимфатических узлов.
Получение спленоцитов: 1) животное забить, покровы про-стерилизовать спиртом; 2) в стерильных условиях извлечь селезенку, поместить в чашку Петри; 3) в шприц набрать среду без сыворотки (RPMI-1640) и многократным укалыванием в разные точки селезенки вымыть из нее клетки; общий объем среды — 10 мл; 4) суспензию клеток перенести в центрифужные пробирки и центрифугировать 7—10 мин при 700 g; 5) осадок суспензировать в новой порции среды без сыворотки (5 мл); 6) подсчитать концентрацию клеток и их жизнеспособность (с помощью витальных красителей). Выход клеток составляет (10—15) • 107, жизнеспособность близка к 100%.
Подготовка миеломных клеток. В гибридомной технологии используют различные миеломные линии (см. обзор: [Ю]). Все они имеют генетические маркеры, позволяющие работать с ними в селективных условиях. Наиболее распространены в настоящее время две линии — Sp 2/0 Agl4 и X63Ag8 6.5.3. Эти клеточные линии имеются во Всесоюзной : коллекции клеточных культур. Обе они являются цроизводными линии РЗК, полученной из миеломы мышей BALB/c МОРС-21. Преимуществом этих клеток является вторичная утрата ими способности синтезировать собственные иммуноглобулины. Клетки дефектны по ферменту гипоксантин-гуанинфосфорибозил-трансфераза, благодаря чему устойчивы к 8-азагуанину и чувствительны к среде ГАТ (см. ниже). Реверсии в этих клетках являются чрезвычайно редким событием, тем не менее рекомендуют каждые
3—6 мес эти клетки культивировать в течение 2—3 пассажей на среде с 8-азагуанином (2• 10_5М).
Миеломные клетки культивируют на среде Игла в модификации Дальбекко (DME) или на среде RPMI-1640 с добавлением 10 % эм-бринальной сыворотки коров. Плотность насыщения для этих клеток— (1.0—1.5) • 106 клеток на I мл. Растут они, частично прикрепляясь к подложке, частично в суспензии. Для слияния используют клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста.
Процедура подготовки клеток для слияния следующая: 1) перенести клетки из культуральных сосудов в центрифужные пробирки; прикрепившиеся к подложке клетки снимают энергичным встряхиванием; 2) центрифугировать 5—7 мин при 700 g; 3) осадок суспензировать в 5 мл ‘ среды без сыворотки; 4) подсчитать концентрацию
клеток. Для слияния обычно используют (10—12) • 10й клеток.
Приготовление раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) (стерилизуют автоклавированием при 120 °С в течение 15 мин): 1) стерильный ПЭГ расплавить в водяной бане; 2) 3 мл среды без сыворотки (RPMI-1640 или DME) нагреть в водяной бане до 50—60 °С; 3) добавить к 3 мл нагретой среды равный объем (3 мл) расплавленного ПЭГ, пипеткой тщательно перемешать; 4) к полученной смеси добавить 0.6 мл ДМСО. Такой раствор можно хранить несколько недель при комнатной температуре или в холодильнике. Непосредственно перед слиянием раствор ПЭГ нагревают до 37 °С. Разные авторы используют ПЭГ с различной молекулярной массой (1000, 1500, 4000).
Процедура слияния: 1) клетки миеломы и спленоциты смешать в соотношении от 1 : 3 до 1 : 1.5— (10-12)- 10б клеток миеломы и (3.0—60)- 10б спленоцитов; 2) центрифугировать 7—10 мин при 700 g; 3) осадок осторожно встряхнуть; 4) добавить к осадку 1 мл ПЭГ, осторожно встряхнуть, инкубировать 1 мин; 5) медленно (1—2) мин, по каплям, каждый раз осторожно встряхивая, добавить
9 мл среды без сыворотки; 6) центрифугировать 7—10 мин при 700 g;
7) осадок суспензировать в 50—60 мл полной ростовой среды.
Среды для роста гибридом. Основной средой является среда DME (с повышенным содержанием глюкозы — 4.5 г/л). Б нее вводят антибиотики (50 мкг/мл гентамицина) и глютамин (2 • 10-3М). поскольку последний является термолабильным компонентом. Выхс/д гибридом повышается при добавлении к среде 5 • 10“5 М 2-меркапто-этанола. Сыворотка (в большинстве случаев работают с эмбриональной сывороткой коров) используется в концентрации 10—20 %. Рост гибридных клеток зависит от качества сыворотки. Рекомендуется предварительно тестировать ростовые качества сыворотки (например, по эффективности клонирования родительских миеломных клеток), чтобы для получения гибридом выбрать наилучшую.
Предыдущая << 1 .. 97 98 99 100 101 102 < 103 > 104 105 106 107 108 109 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed