Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
«Питающие» клетки. Размножение медленно растущих гибридных клеток стимулируется добавлением к высеваемой суспензии не-размножающихся клеток, называемых «питающими». Источники их различны: тимоциты, спленоциты, макрофаги. Предпочтительнее использовать перитонеальные клетки. Значительную долю последних составляют макрофаги, секретирующие ростстимулирующие факторы для гибридом. Кроме того, макрофаги выполняют еще одну важную функцию: они фагоцитируют погибающие в ходе селекции неслив-шиеся миеломные клетки. Последние при гибели выделяют в среду токсины, ингибирующие рост гибридных клеток.
Перитонеальные клетки получают от мышей разных штаммов: сингенность животных не является обязательным требованием при выборе донора «питающих» клеток. Не рекомендуется брать клетки от животных, стимулированных к продукции макрофагов: активированные макрофаги могут фагоцитировать гибридомные клетки.
Получение перитонеальных клеток: 1) забить мышь, положить спинкой вниз на подставку, облить тушку спиртом для стерилизации;
2) осторожно, чтобы не повредить стенку брюшины, сделать продоль-
ный разрез кожи, верхние и нижние поперечные разрезы, растянуть кожу в противоположных направлениях, при этом обнажается брюш-•рдя полость; 3) шприцем ввести в брюшную полость 5 мл полной ростовой среды; 4) массировать брюшную полость 2—3 мин;
5) собрать шприцем суспензию клеток из брюшной полости; 6) подсчитать концентрацию клеток. От одной мыши получают (3—5) • 106 клеток. Их используют из расчета (0.5—1) • 104 клеток на 1 ячейку планшета с 96 лунками. «Питающие» клетки рассеивают ка планшеты за 2—3 сут до слияния либо их добавляют к суспензии клеток мие-ломы и спленоцитов в момент рассева после слияния.
Рассев клеток после слияния. Суспензию клеток в полной ростовой среде разливают по 100 мкл в каждую ячейку 96-луночных планшетов. В одном эксперименте мы используем 5—6 планшетов. В одну ячейку при этом попадает (0.5—1) • 105 клеток. Через 24 ч после посева гибридизированных клеток в каждую ячейку добавляют по 100 мкл селективной среды ГАТ (двойной концентрации). Таким образом, объем среды в каждой ячейке становится равным 200 мкл, а концентрация среды ГАТ уменьшается в 2 раза. Клетки инкубируют при 37 °С в атмосфере с 5 % СОг.
Приготовление 100-кратного раствора среды ГАТ (маточные растворы компонентов этой среды хранят при —20 °С).
Аминоптерин (молекулярная масса 440.4): 1) добавить к 1.76 мг аминоптерина 90 мл деионизированной воды; 2) добавить по каплям 1 н. NaOH до полного растворения аминоптерина; 3) нейтрализовать раствор 1 н. НС1 до pH 7.5; 4) довести объем до 100 мл; 5) раствор простерилизовать через фильтр с порами 0.22 мкм; 6) разлить по 5 мл. Хранить‘*при —20 °С. Конечная концентрация аминоптерина —
4 • 10~7М. Потенциальный канцероген! Работать в перчатках!
Гипоксантин (молекулярная масса 136.1): 1) добавить 136 мг гипоксантина к 90 мл деионизированной воды; 2) добавить по каплям 1 н. NaOH до полного растворения гипоксантина; 3) нейтрализовать раствор 1 н. НС1 до pH 7.5; 4) довести объем до 100 мл; 5) раствор простерилизовать через фильтр с порами 0.22 мкм; 6) разлить по 5 мл. Хранить при —20 °С. Конечная концентрация гипоксантина — 1 • 10~4 М.
Тимидин (молекулярная масса 242.2): 1) добавить 38.7 мг тими-дина к 100 мл деионизированной воды; 2) раствор простерилизовать через фильтр с порами 0.22 мкм; 3) разлить по 5 мл. Хранить при —20 °С. Конечная концентрация тимидина— 1.6 • 10-5М.
Определение специфических антител,
продуцируемых гибридомами
Через 5—7 сут после слияния, если оно прошло успешно, колонии растущих гибридных клеток становятся микроскопически видимыми. Для роста гибридных клеток в низкой (клональной) плотности существенное значение имеет кондиционирование среды, поэтому первую смену среды осуществляют при увеличении числа клеток в колонии примерно до 100. При смене среды ГАТ аминоптерин,
присутствующий в клеточном пуле, может тормозить синтез пуринов и пиримидинов в клетке. Для обеспечения клеток экзогенными предшественниками синтеза ДНК при первой смене среды ГАТ замещается на среду ГТ (содержащую гипоксантин и тимидин в тех же концентрациях, что и среда ГАТ). При последующих сменах среды, которые осуществляются с интервалом 2 сут (плотность культуры увеличивается), добавляется среда без добавок для селективных сред.
При достижении в ячейках плотности клеток 30 % и более можно проводить тестирование гибридных клеток на продукцию специфических антител. Способ тестирования определяется свойствами иммуногена, а также целью эксперимента — будущей аппликацией антител.
Наиболее распространенными методами являются иммунофлюоресценция, твердофазный радиоиммунологический анализ (ТРИА) и твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА). Ввиду большей биологической безопасности последнего по сравнению с ТРИА он получил в последние годы самое широкое распространение.
Для проведения ТИФА используют специальные плоскодонные 96-луночные планшеты. На них наносят антиген (растворимые белки, клетки), который благодаря определенным свойствам пластика сорбируется на нем. Следует, однако, подчеркнуть, что сорбция растворимых антигенов имеет место только в том случае, если они являются заряженными или полярными молекулами и поэтому определенным образом связываются с модифицированой поверхностью пластика в Na-карбонатном буфере, pH 9.5. Если антигеном являются клетки, то фиксация их к пластику осуществляется с помощью поли-Ь-лизина (10 мкг/мл) или глютаральдегида (0.25—1.50 %).
