Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
При первом клонировании гибридом-продуцентов наблюдается расщепление клонов по способности продуцировать специфические антитела. Причины нестабильности гибридом широко обсуждаются (см., например, [4]). Одной из основных причин нестабильности гибридом считают элиминацию хромосом, несущих иммуноглобулиновые гены. Однако возможны и иные механизмы (как генотипические, так и фенотипические), в силу которых гибридные клетки перестают синтезировать иммуноглобулины.
Отбираются позитивные клоны, которые подвергаются реклонированию. При выборе клонов-продуцентов для дальнейшего клонирования могут возникать тактические трудности. Они становятся очевидными, если популяция тестированных клонов составляет большинство проанализированных клонов. Поэтому параллельно с клонированием некоторых позитивных гибридом (высокопродуктивных, активно пролиферирующих) все позитивные клоны следует поддерживать культивированием в течение 10—14 сут, после чего их повторно проанализировать на продукцию антител. При повторном тестировании количество позитивных клонов может уменьшиться за счет выявления менее стабильных клонов. Позитивные клоны клонируют повторно (условия клонирования те же).
При таком подходе при втором клонировании число позитивных клонов оказывается близким к 100 %. Если нет, то процедура и тактика повторяются. На всех этапах клонирования гибридные клетки параллельно размножаются в небольших количествах на пластинах с 24 ячейками и криоконсервируются.
Массовая продукция антител
После получения гибридомного клона, стабильно продуцирующего специфические антитела, следующим этапом является наработка их в большом количестве. Это достигается культивированием клеток либо in vitro, либо in vivo.
Культивирование гибридом in vitro. Продукция антител при рутинных способах культивирования in vitro является низкой (единицы—десятки микрограммов на 1 мл). Преимуществом этого метода является упрощение процедуры очистки антител. Кроме того, низкая концентрация антител, присутствующих в культуральной среде, оказывается достаточной для проведения некоторых тестов с использованием моноклональных антител.
При длительном пассировании гибридом в культуре следует иметь в виду их высокую чувствительность к условиям культивирования. К ним относятся качество посуды, состав среды, pH, плотность культуры и др. Лимитирующей размножение является как высокая, так и низкая плотность культуры. В переросших культурах накапливаются токсические вещества и клетки быстро погибают. Существенное значение в контроле размножения имеет pH среды. При повышении pH деление клеток прекращается. При восстановлении pH до оптимальных значений (pH 7.5—7.6) происходит восстановление клеточной пролиферации, однако время этого восстановительного периода является функцией времени, в течение которого клетки находились в среде с щелочными pH: 5 сут после 24-часового пребывания при pH 8.3 и 11 сут после 72 ч [4].
'' Клетки культивируют на среде с сывороткой (5—10 %) или без нее. В последние годы бурно развивается технология культивирования клеток на бессывороточных средах. Преимущества ее очевидны:
1) стандартизируются условия культивирования (сыворотка — биологическая жидкость, состав которой сильно варьирует);
2) облегчается очистка антител, поскольку упрощается белковый состав среды и уменьшается концентрация белка; 3) отсутствуют экзогенные иммуноглобулины, что упрощает исследование многих параметров иммуноглобулинов (изотипа, концентрации и др.).
Основными компонентами заменителей сыворотки являются транспортные белки, липиды, гормоны, агенты, стимулирующие секрецию антител, и др. Эти компоненты добавляются к среде определенного химического состава. В нашей лаборатории для культивирования гибридом применяется среда, предложенная Мураками и соавторами [И]. В качестве базовой среды используется смесь среды F-12 и DME (1:1). К ним добавляются инсулин (5 мкг/мл), трансферрин (35 мкг/мл), этаноламин (0.02 М), селенит (2.5 • 10~3М), HEPES (15 • 10-3М). На такой среде гибридомы поддерживаются in vitro в течение многих пассажей и сохраняют продукцию антител.
Для увеличения концентрации антител в культуральной среде разрабатываются подходы культивирования клеток на полых волокнах, микрокапсулах и др. [12].
Культивирование гибридом in vivo. Другим подходом к накоплению антител является культивирование гибридом in vivo. При прививке сингенным мышам гибридомные клетки образуют опухоли. Опухолевые клетки растут частично в солидной, частично в асцитной форме. Концентрация антител в асцитной жидкости возрастает
по сравнению с культуральной средой на 2—3 порядка и составляет единицы—десятки миллиграммов на 1 мл.
Образованию асцита способствует предварительная инъекция животным пристана или вазелинового масла. Их инъецируют за 7—14 сут до введения клеток по 0.5 мл на 1 мышь, внутрибрю-шинно. Суспензию гибридомных клеток в PBS, (1—2) • 106 клеток (0.5 мл) на 1 мышь, также инъецируют внутрибрюшинно.
Опухоли образуются через 2—3 нед после прививки. Асцитную жидкость (2—3 порции) забирают через' 2—3-суточные интервалы у живых мышей, вводя им в брюшную полость иглу. Для получения последней порции животных забивают, открывают брюшную полость, иглой собирают асцитную жидкость.
