Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Вахтин Ю.Б. -> "Методы культивирования клеток" -> 105

Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.

Вахтин Ю.Б., Соминина А.А. Методы культивирования клеток — Л.: Наука, 1988. — 313 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikultivirovaniya1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 99 100 101 102 103 104 < 105 > 106 107 108 109 110 111 .. 171 >> Следующая

Процедура ТИФА для растворимых белков: 1) раствор антигена (1 мкг/мл) готовят в 0.2 М Na-карбонатном буфере, pH 9.5; приготовление буфера: 13 мл 0.2 М Na2C03 (2.12 г Na2C03 растворить в 100 мл дистиллированной воды)+37 мл 0.2 М NaHC03 (1.68 г NaHC03 растворить в 100 мл дистиллированной воды); 2) добавить . 70 мкл раствора антигена в лунки планшета (через ряд, вертикально), инкубировать 1 ч при 37 °С или более 2 ч при комнатной температуре;
3) встряхнуть, промыть водопроводной водой, затем PBS1 с 0.05 % твина-20; 4) во все ячейки нанести блокирующий раствор (0.5— 1.0 %-ного овальбумина, бычьего сывороточного альбумина или 0.1—0.2 %-ной желатины в PBS), инкубировать 1 ч при 37 °С (в блокирующем растворе пластины можно хранить в холодильнике несколько суток); 5) после инкубации встряхнуть; в первые две вертикальные дорожки нанести по 70 мкл ростовой среды, в остальные — по 70 мкл культуральной среды от тестируемых гибридом; среду от каждой гибридомы нанести в 2 ячейки (с антигеном и с блокирующим раствором); инкубировать 1 ч при комнатной температуре; 6) встряхнуть, промыть водопроводной водой, потом PBS с 0.05 % твина-20; 7) во все ячейки добавить по 70 мкл конъю-
1 Раствор Дульбекко и Фогта без солей кальция и магния см. в статье А. Д. Тарта-ковского (наст, сб.), табл. 1.
гата антимышиных иммуноглобулинов с пероксидазой в соответствующем разведении в растворе блокирующего агента с 0.05 % твина-20, инкубировать 1 ч при комнатной температуре; 8) встряхнуть, промыть водопроводной водой, затем PBS с 0.05 % твина-20; 9) приготовить раствор субстрата-хромогена (5 мг о-фениленди-амина растворить в 10 мл 0.1 М натрий-цитратного буфера, pH 4.5), добавить 3—5 мкл 30 %-ной Н2О2, быстро нанести по 70 мкл во все ячейки планшетов, инкубировать в темноте 10—60 мин; реакцию можно остановить добавлением в каждую ячейку 5 мкл 2 М H2SO4 (приготовление 0.1 М натрий-цитратного буфера: смешать 89 мл 0.1 М лимонной кислоты и 111 мл 0.1 М цитрата натрия, довести pH до 4.5); 10) оценить результаты: качественно — ячейки с желтым раствором позитивные; количественно — с помощью спектрофото-метрии при 492 нм. Первые две вертикальные дорожки — контроль. В этих ячейках раствор должен быть прозрачным.
Культуральная среда от каждой гибридомы тестируется параллельно на двух ячейках. В одной их них присутствует антиген, в другой только блокирующий раствор. При первичном тестировании такой подход кажется обязательным, поскольку при слиянии часто образуются гибридомы, продуцирующие антитела, обладающие высоким сродством к разным антигенам. Они выявляются как позитивные и на иммуногене, и на блокирующем белке и не могут рассматриваться как специфичные к иммуногену. Причина появления таких гибридом и природа иммуноглобулинов, синтезируемых ими, неизвестны.
Анализ позитивных клонов повторяется дважды для большей достоверности результатов. Позитивные клоны клонируют и размножают для криоконсервации. Первым этапом в размножении является перенос клеток из 96-луночных планшетов в 24-луночные из одной ячейки на одну (при условии наличия в 24-луночных планшетах питающих клеток). На этом этапе небольшие количества гибридом-ных клеток могут быть криоконсервированы.
Клонирование
Исходные гибридные клетки могут иметь неклональное происхождение, особенно если гибридные колонии растут в большинстве ячеек. Они могут представлять собой смесь клонов-продуцентов и непроду-центов, а также смесь разных клонов-продуцентов. Для получения моноклональных антител необходимо, чтобы производящие их клетки были потомками единичных клеток. Достигается это последовательными этапами клонирования, которое осуществляется 2—3, а иногда и более раз.
Наиболее распространенным способом клонирования является метод лимитирующего разведения в жидкой фазе: 1) засеять 96-луночные планшеты перитонеальными клетками (1 • 104—2 • 104 клеток в 100 мкл ростовой среды на лунку), инкубировать 1—2 сут при 37 °С в атмосфере с 5 % С02; 2) подсчитать концентрацию клеток в ячейках -с растущими гибридами; для клонирования выбираются
ячейки с жизнеспособными клетками, находящимися в логарифмической фазе роста; 3) путем разведения приготовить 10 мл суспензии клеток в ростовой среде, содержащей 1—3 клетки на 1 мл; 4) рассеять суспензию гибридных клеток на планшеты с питающими клетками по 100 мкл на ячейку.
Колонии растущих клеток становятся микроскопически видимыми через 5—7 сут. Рост клеток в таких условиях подчиняется распределению Пуассона [3]: /(0) = е~\ где f(0) — фракция ячеек, в которых отсутствует рост, к — среднее число колоний в одиой ячейке. Если Л,= 1, то f(0) = 0.37. Это значит, что при отсутствии роста в 37 % ячеек в остальных ячейках с растущими клетками колонии происходят из единичных клеток. Однако такая ситуация может оказаться ложной из-за неоднородности ячеек (токсичности).
Тестирование проводят на 10—14-е сутки после клонирования. В течение этого периода смена среды не обязательна. Для анализа выбираются ячейки, содержащие единичные колонии, различимые микроскопически. Как правило, выборка из 20—30 клонов оказывается достаточной для тестирования.
Предыдущая << 1 .. 99 100 101 102 103 104 < 105 > 106 107 108 109 110 111 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed