Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Литература
1. Kohler G., Milstein С. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. Vol. 256. P. 495—497.
2: Моноклональные антитела /' Под ред. Р. Кеннетта и др. М., 1983. 416 с.
3. Goding J. Antibody production by hybridoma // J. Immunol. Meth. 1980. Vol. 39. P. 285—308.
4. Westerwoudt К¦ Improved fusion methods. 4. Technical aspects // J. Immunol. Meth. 1985. Vol. 77. P. 181 — 196.
5. Croce C., Linnenbach A., Dolby Т., Koprowski H. The use of mouse-human liybrido-mas in human genetics and immunology // Somatic cell genetics. New York; London, 1982. P. 55—68.
6. Келер Г. Метод получения гибридом // Методы исследования в иммунологии. М., 1983. С. 402—406.
7. Stahli С., Staeheli Т., Miggiano V. et al. High frequency of antigen-specific hybridoma: dependence of immunization parameters and prediction of spleen cell analysis // J. Immunol. Meth. 1980. Vol. 32. P. 297—309.
8. Reading C. Theory and methods for immunization in culture and monoclonal antibody production //J. Immunol. Meth. 1982. Vol. 53. P. 261—291.
9. Wu S., Ma M. In vitro immunization with EL-4 conditioned medium for hybridoma production //J. Tissue Cult. Meth. 1985. Vol. 9. P. 147—149.
10. Фридлянская И. И. Постоянные клеточные линии, дифференцирующиеся in vitro // Биология клетки в культуре. Л., 1984. С. 50—100.
11. Murakami Н., Masui Н., Sato G. et al. Growtbnof hybridoma cells in serum-free medium: ethanolamine is essential component // Proc. Nat. Acad. Sci.USA. 1982. Vol. 79. P. 1158—1162.
12. Boss M. Large scale production of monoclonal antibodies//Biotechnology. 1985. Vol. 2. P. 179—188.
13. Brodeur B., Tsang T. High yield monoclonal antibody production in ascites // J. Immunol. Meth. 1986. Vol. 86. P. 239—241.
14. Price P. A simple, rapid method for freezing hybridomas //J. Tissue Cult. Meth. 1985. Vol. 9. P. 167—169.
Генетическая трансформация соматических клеток
О. К. Глебов
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Способы введения в соматические клетки векторных ДНК, несущих клонированные последовательности, и методы выявления клеток, содержащих определенные рекомбинантные молекулы ДКК, представляют собой наряду с методами клонирования в бактериальных клетках нужных последовательностей эукариотных ДНК основные
элементы генной инженерии эукариот — методологии, революционизировавшей в последнее десятилетие исследования не только в генетике соматических клеток, но и в молекулярной клеточной биологии. Попытки введения в соматические клетки чужеродной ДНК с целью выявления наследуемых изменений признаков, обусловленных экспрессией чужеродных генов (т. е. с целью генетической трансформации соматических клеток), неоднократно предпринимались с момента установления генетики соматических клеток как самостоятельной дисциплины [1—4], но доказательство того, что измененный фенотип действительно определяется экспрессией чужеродного гена, было получено только в 1973 г. [5]. В 1977 г. появился ряд сообщений
о трансформации соматических клеток мыши и человека фрагментами ДНК ВПГ1, содержащими ген ТК [6—8]. Успех этих работ был связан с использованием для трансформации кальцийфосфат-ного преципитата ДНК. Этот метод, как было показано ранее, существенно повышает инфекционность ДНК аденовируса при трансфекции соматических клеток [9]. В первых экспериментах по введению клонированного гена ТК ВПГ1 в соматические клетки было обнаружено, что спустя 24—72 ч после введения этот ген экспрессируется в значительной части клеток, доля которых с течением времени, однако, быстро падает [10, 11]. Стратегия экспериментов, в которых активность чужеродных генов изучается спустя короткое время (36—72 ч) после их введения в соматические клетки, получила затем широкое распространение; этот подход был назван методом временной экспрессии чужеродных генов (см. обзоры: [12, 13]). Методы введения генов в соматические животные клетки в культуре и собственно метод генетической трансформации соматических клеток за короткий срок стали обязательными в лабораториях,
' занимающихся решением как фундаментальных проблем (связанных, например, с анализом функциональной роли тех или иных последовательностей эукариотной ДНК, изучением рекомбинации ДНК и мутагенеза и т. д.), так и прикладных задач, в частности выделения и идентификации генов эукариот и создания клеток-продуцентов полезных белков (см. обзор; [14]). Это обусловлено разработкой более эффективных методов введения генов в клетки и более чувствительных методов определения продуктов активности генов.
Несмотря на высокую частоту генетической трансформации соматических клеток (например, с помощью микроинъекций [15, 16] или при инфицировании клеток рекомбинантными ретровирусами [17]), до сих пор не описано ни одного случая, когда клоны генетически трансформированных клеток были бы выделены без использования специальных селективных сред. Возможно, это связано с тем, что установление трансформантного фенотипа клеток, обусловливающего их способность переживать на селективной среде, происходит (по неизвестным причинам) только при культивировании на селективной среде (на 3—6-е сутки после микроинъекции [18]).
