Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Асцитные жидкости центрифугируют 5—7 мин при 200 g. Снимают с поверхности минеральное масло. Надосадочную жидкость переносят в новый сосуд. Хранят при 4 °С. Для консервации добавляют
0.1 % азида натрия. При таком подходе от одного животного удается получить около 15 мл асцита.
Осадок клеток используют для инъекции новой группе животных, которым также вводят вазелиновое масло или пристан. Многие гибридомные штаммы стабильны в течение многих перевивок in vivo. Возрастает и объем асцитной жидкости на животное.
Обычно асцитные опухоли получают у мышей линии BALB/c, поскольку для иммунизации в основном используют этих животных. Для накопления большого количества антител требуются большие партии животных. Иногда это может являться проблемой. В таких случаях индукцию опухолей можно проводить на F, (tf BALB/c X Х9 беспородных мышей). Объем асцита при этом увеличивается (до 30 мл от одного животного), но несколько задерживается время образования опухолей [13].
Криоконсервация гибридом
Процесс получения клеточных линий, стабильно продуцирующих моноклональные антитела, является длительным и трудоемким. Одновременно в работе оказываются сотни культур, отличающихся по жизнеспособности, скорости пролиферации и, следовательно, требующих для поддержания индивидуального подхода. Кроме того, при длительном культивировании возникает опасность заражения клеток.
Страхование клеточного материала осуществляют с помощью криоконсервации. На всех этапах гибридомной технологии (тестирования, клонирования) клетки дополнительно размножают и замораживают в жидком азоте.
На начальных этапах работы длительно размножать клетки не следует, поскольку гибридомы могут быть нестабильны. Для криоконсервации могут быть использованы клетки, растущие в 24-луноч-ных планшетах. Выбираются ячейки с жизнеспособными клетками при плотности 70—80 %.
Процедура замораживания: 1) за 24 ч сменить среду; добавить
1.5 мл свежей ростовой среды в каждую ячейку; 2) для криоконсервации суспензировать клетки в среде, в которой они росли, часть клеток адгезивна, поэтому пипетировать нужно многократно, но осторожно, чтобы не повредить клетки; 3) из лунки отобрать 1 мл суспензии, к оставшимся клеткам добавить свежую ростовую среду; 4) приготовить криопротектор: 20 %-ный ДМСО в сыворотке; 5) к клеточной суспензии медленно, по каплям, добавить равный объем 20 %-ного ДМСО; таким образом, среда для криоконсервации оказывается следующего состава: 45 % кондиционированной среды, 45 % сыворотки, 10 % ДМСО; 6) подготовленную суспензию разлить по ампулам.
Режимы замораживания гибридомных клеток не отличаются от принятых для других типов клеток (подробнее см. статью А. А. Цу-цаевой и Т. Ф. Петренко, наст. сб.).
При оттаивании: 1) содержимое ампулы перенести в центрифужную пробирку, медленно, по каплям, перемешивая, добавить 10-кратный объем среды; 2) центрифугировать 5—7 мин при 700 g;
3) к осадку добавить 1 мл свежей среды; 4) суспензию клеток перенести в 1 ячейку 24-луночного планшета с питающими клетками.
Метод криоконсервации клеток в 96-луночиых планшетах [14]: 1) сменить среду за сутки до консервации; 2) добавить в каждую ячейку по 100 мкл сыворотки с 10 % ДМСО; 3) обернуть пластину клейкой лентой, затем пластиковой пленкой, поместить на тающий лед; 4) поместить в холодильник при —43 °С; 5) через сутки быстро перенести в пары жидкого азота.
При оттаивании: 1) из жидкого азота планшеты быстро перенести в культуральное рабочее помещение; 2) добавить в каждую ячейку по 0.2 мл среды без сыворотки, прогретой до 40 °С; 3) поместить планшеты в инкубатор при 37 °С на 3 мин; 4) удалить среду, добавить свежую ростовую среду.
После получения стабильных линий, продуцирующих МонАТ, клетки могут быть криоконсервированы большими партиями (см. статью А. А. Цуцаевой и Т. Ф. Петренко, наст. сб.).
Возможные трудности в получении гибридом
Многие проблемы уже были упомянуты при описании отдельных этапов гибридомной технологии (подбор оптимальной среды, условий культивирования, тестирования и др.). Осложняет работу с гибридо-мами возможность инфекций. Поскольку в культуральную среду при получении и культивировании добавляют гентамицин (50 мкг/мл), то бактериальное заражение наблюдается чрезвычайно редко. Основную трудность представляет заражение плесневыми грибами, источником которого являются некоторые типы СОг-инкубаторов. Некоторые авторы используют противогрибковые антибиотики, например фунгизон. Однако они являются высокотоксичными.
Как правило, плесневая инфекция в первую очередь появляется в краевых лунках и может быстро распространиться. В ячейку, где обнаружено заражение, можно добавить 1 каплю 1 %-ного мертио-лата. Через 5 мин содержимое ячейки отсосать, снова добавить
1 каплю мертиолата, снова отсосать. Попадание мертиолата в соседние ячейки вызывает гибель клеток в них.
Очень часто неудачи в получении гибридом при слиянии связаны с микоплазменной инфекцией. Клетки, зараженные микоплазмой, не растут на среде ГАТ. Перед слиянием миеломные клетки должны быть проконтролированы на отсутствие микоплазм (см. статью Г. Г Миллер и др. в наст. сб.). Микробиологический контроль периодически должен осуществляться и при длительном пассировании гибридом. Микоплазменная инфекция может угнетать рост клеток вплоть до их полной дегенерации.
