Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Вахтин Ю.Б. -> "Методы культивирования клеток" -> 100

Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.

Вахтин Ю.Б., Соминина А.А. Методы культивирования клеток — Л.: Наука, 1988. — 313 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikultivirovaniya1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 171 >> Следующая

Мы приводим два новых метода селекции, не требующих использования линий клеток с генетическими маркерами. Один из них базируется на предварительном введении в клетки-партнеры антител к двум различным токсинам и на последующем выживании гибридов на среде с этими токсинами, так как они несут антитела против них обоих [13]. Второй метод основан на защите гибридных клеток от вируса (выступающего в качестве селективного агента) с помощью видоспецифических интерферонов [35].
Селекция методом «токсин—антитоксин» [13]. Метод основан на предварительном введении в клетки А антител против рицина, а в клетки Б — антител против дифтерийного токсина. После слияния клетки инкубируют в среде с рицином и дифтерийным токсином, в результате чего выживают только клеточные гибриды, защищенные антителами обоих видов. Метод разработан на диплоидных фибро-бластах человека.
1. Клетки обрабатывают трипсином, снимают с матрасов средой с 10 % сыворотки, подсчитывают число клеток в камере Горяева, затем клетки осаждают центрифугированием (5 мин, 700 g), ресуспензируют в среде без сыворотки, вновь осаждают, сливают супернатант и центрифугируют еще раз (2 мин, 700 g), после этого тщательно отсасывают пипеткой остатки жидкости из пробирки.
2. Ресуспензируют 107 клеток в 0.2 мл бессывороточной культуральной среды, содержащей сахарозу (0.5 М, гипертонический раст-
вор) и ПЭГ-1000 (10 %), а также антитела против рицина (для клеток А) или против дифтерийного токсина (для клеток Б); могут быть использованы как моноклональные мышиные, так и поликлональные кроличьи антитела. Предварительно АТ осаждают 50 %-ным раствором сульфата аммония, диализируют против 6 • 10~3М натрий-фосфатного буфера (pH 7.2), стерильно фильтруют и лиофилизируют, после чего растворяют в малом объеме гипертонического раствора. Концентрация антител в гипертоническом растворе должна быть по крайней мере в 15—20 раз выше, чем в исходной сыворотке (для поликлональных антител) или в культуральной среде (для моноклональных антител). Для получения антител к рицину животных следует иммунизировать рицином, обработанным формальдегидом. Клетки инкубируют в гипертоническом растворе с антителами в течение 10 мин. В это время клетки пиноцитируют раствор.
3.. Добавляют 10 мл теплой смеси бессывороточной среды и дистиллированной воды (6 : 4). В результате гипотонического шока пи-ноцитозные пузырьки, содержащие раствор антител, разрываются и их содержимое поступает в цитоплазму. Инкубация клеток в гипотоническом растворе продолжается 2 мин при 37 °С. Далее клетки осаждают центрифугированием (5 мин, 700 g) и ресуспензируют в 10 мл теплой изотонической культуральной среды, инкубируют 10 мин при 37 °С.
4. Смешивают клетки А и Б (по 107 клеток) и осаждают центрифугированием (5 мин, 700 g), сливают супернатант. Центрифугируют еще 2 мин при 700 g. Отсасывают остатки жидкости.
5. Ресуспензируют клетки в 0.2 мл бессывороточной культуральной среды, содержащей 35 % ПЭГ-1000 и 10 % диметилсульфоксида. Инкубируют 45 с.
6. Добавляют 10 мл культуральной среды с 10 % сыворотки эмбрионов коров. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Центрифугируют 5 мин при 700 g. Ресуспензируют в полной культуральной среде (с 20 % сыворотки эмбрионов коров), содержащей рицин и дифтерийный токсин в заранее подобранных концентрациях. Высаживают в культуральную посуду с плотностью не более (25—50) • 103 клеток на 1 см2. Для диплоидных фибробластов концентрации рицина и дифтерийного токсина в селективной среде составляли 3 нг/мл. Для предварительного подбора концентраций токсинов некоторое количество клеток А, в которые были инъецированы антитела к рицину, и клеток Б с антителами к дифтерийному токсину инкубируют в течение 20 ч с соответствующими токсинами в различных концентрациях, а затем 3 сут без токсинов. Одновременно в аналогичных условиях проводят инкубацию клеток, не подвергавшихся инъекциям. Подбирают такие концентрации токсинов, при которых погибают все неинъецированные клетки и выживает максимальное количество клеток, подвергавшихся инъекции антител. Для подбора используют концентрации токсинов в диапазоне от 0.03 до 30 нг/мл.
7. Через 15—20 ч переводят клетки в полную культуральную среду без токсинов.
Данная система селекции не годится для клеток мышевидных грызунов, которые резистентны к дифтерийному токсину. Работая с этими клетками, можно заменить дифтерийный токсин другим ядом — абрином, и соответственно инъецировать в клетки перед слиянием антитела к абрину.
Селекция методом «интерферон—вирус». Метод разработан на человеческих клетках J-96 и на мышиных клетках L929 [35]:
1) по 107 клеток человека и мыши сливают в суспензии с помощью полиэтиленгликоля (см. метод 2.2); 2) высевают клетки во флаконы или в чашки Петри из расчета 3 • 105 клеток в 1 мл в культуральной среде с 20 % сыворотки крупного рогатого скота; через 24 ч заменяют культуральную среду на свежую того же состава; 3) через 18 ч производят замену на среду с 2 % сыворотки эмбрионов коров с добавлением мышиного сывороточного интерферона, 50 ед/мл; 4) через 6 ч вводят в среду вирус везикулярного стоматита (штамм Индиана) в дозе 104 ТПД50/мл; 5) через 18 ч после гибели одноядерных клеток человека и гомокарионов, образовавшихся в результате слияния клеток человека друг с другом (эти клетки не имеют рецепторов для мышиного интерферона и, следовательно, не могут быть им защищены от вируса), клетки отмывают от вируса раствором Хэнкса; добавляют среду с 20 % сыворотки эмбрионов коров и лейкоцитарным человеческим интерфероном (80 МЕ/мл); 6) через 6 ч вводят вирус везикулярного стоматита в дозе 104 ТПД50/мл; 7) через 18 ч, когда произошла гибель клеток мыши, не имеющих рецепторов для человеческого интерферона, отмывают клетки от вируса раствором Хэнкса и добавляют среду с 20 % сыворотки эмбрионов коров с удвоеннкм содержанием глютамина.
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed