Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Оба этапа, как диэлектрофорез клеток, так и слияние, контролируют под микроскопом: 1) клетки А и Б, взятые для слияния, перемешивают в соотношении 1:1, промывают 1 раз раствором Хэнкса и затем после двукратной промывки переводят в среду с низкой ионной силой следующего состава: 0.28 М. инозит, 1 • 10~3М фосфатный буфер (К2НРО4/КН2РО4), 5 • 10-4М Mg(CH3COO)2, 1 • 10-4М Са(СН3СОО)2, в простейшем случае данная среда может быть заменена на незабуференный 0.3 М. маннит или сахарозу;
2) 50—100 мкл суспензии, содержащие 103—104 клеток, переносят
в ячейку и включают переменное поле с амплитудой ?пик=0.2ч--f-0.8 кВ/см и частотой /=0.5-=-1 МГц (заметим, что при ширине межэлектродного зазора 0.1 мм напряжение V, необходимое для достижения данной величины поля, равно 2—8 В; за 0.5—3 мин клетки концентрируются в зазоре между электродами и формируют характерные цепочки); подбором плотности клеточной суспензии и напряженности переменного поля можно добиться образования значительного числа цепочек, состоящих только из двух клеток, некоторая доля таких клеточных пар будет представлять искомую комбинацию А+Б; 3) в ходе диэлектрофореза, длящегося 0.5—5 мин, на цепочки накладывают несколько (1—5) последовательных импульсов (/=5-f-50 мкс, Е=2.54-5 кВ/см) и затем для поддержания целостности цепочек еще в течение минуты переменное поле оставляют включенным; 4) переменное поле выключают, и через 2—5 мин в ячейку осторожно добавляют 100—200 мкл среды следующего состава: 0.132 М NaCl, 8- 10_3 М КС1, 0.01 М буфера (Na2HP04/ NaH2P04), 5- 10~4 М Mg(CH3COO)2 и 1- 10“4 М Са(СН3СОО)2, в которой в течение 20—30 мин происходит собственно процесс слияния клеток; 5) при помощи пипетки или микрошприца все содержимое ячейки переносят в питательную среду с 10—15 % сыворотки для дальнейшего культивирования. За один цикл таким образом можно получить 10—100 гибридных клеток.
Возможные модификации: 1) для удобства наблюдения клетки типа А и типа Б предварительно могут быть окрашены витальными красителями, например нейтральным красным (0.24 мг/мл, 30 мин) или янусом зеленым (0.12 мг/мл, 30 мин) [19]; 2) после процедуры диэлектрофореза часть клеток оказывается плотно адгезированной на поверхности электродов; чтобы избежать этого, диэлектрофорез клеток проводят на поверхности стекла между двумя плотно прижатыми к нему электродами в среде следующего состава: 0.3 М маннит,
1- 10“3MMgCl2, 1- 10“4МСаС12,5- 10-3 М Трис-НС1 (pH 7—7.4)
[25]; в этом случае клетки практически не соприкасаются с электродами, легче получить и хорошее микроскопическое изображение;
3) для увеличения эффективности слияния в среду электрообработки можно добавлять ферменты, частично удаляющие гликокаликс: проназу Е («Serva», 50—100 мкг/мл), диспазу («Boehringer», 10— 20 мкг/мл) или нейраминидазу («Koch-Light», 10 мкг/мл); 4) использование спиральной ячейки специальной конструкции [26] позволяет превратить описанный микроспособ в макроспособ и обрабатывать до 10® клеток одновременно.
3.3. Электрослияние с применением диэлектрофореза в однородном электрическом поле: макрофособ [27]. Находясь в однородном переменном электрическом поле, клетки подвергаются взаимному диэлектрофорезу, т. е. благодаря возникновению наведенных диполей они притягиваются и приходят в плотный контакт. Приложенный в этот момент импульс высокой амплитуды вызывает слияние клеток.
Метод предполагает обработку достаточно больших объемов клеточной суспензии (0.1 — 1 мл), поэтому для достижения достаточной для слияния напряженности электрического поля (2—5 кВ/см)
при не слишком узком межэлектродном зазоре (0.5 мм и более) удобно иметь генератор высоковольтных импульсов.
Схема наиболее простого устройства, позволяющего формировать экспоненциально затухающие импульсы, приведена на рисунке (г)
[26]. Накопительный конденсатор) (С), заряженный от источника высокого напряжения (/), разряжается через ячейку (Я). Разряд достигается включением коммутирующего элемента, в качестве которого может быть использован высоковольтный теристор (Т) или тиратрон. Пиковая амплитуда импульса определяется напряжением, до которого заряжен конденсатор. Длительность импульса, т. е. характерное время т, за которое напряжение спадает в е раз, определяется по формуле x=RC, где С — (емкость накопительного конденсатора, R — сопротивление ячейки. Таким образом, длительность т можно подбирать, изменяя либо емкость, либо ионную силу и соответственно проводимость раствора в ячейке.
Блок-схема формирователя квазипрямоугольных импульсов от источника высокого напряжения (/) приведена на рисунке (д). Включением теристора Т\ формируется передний фронт импульса; последующее шунтирование цепи теристором Т2, включаемым с некоторой задержкой t, формирует задний фронт импульса. Таким образом, импульс состоит из двух экспонент: сначала медленно спадающей, а затем быстро спадающей. Подбором величин емкости С (2—10 мкФ) и шунтирующего сопротивления Rm (0.5—1 Ом) можно добиться практически прямоугольной формы импульса.
Источником высокого напряжения (/) в обеих схемах может послужить любой лабораторный источник, используемый для гель-электрофо^еза, коммутирующими элементами — теристоры ТЧ-100 или ТЧИ-100, а в качестве блока задержки в схеме формирователя можно использовать генератор Г5-54. Необходимо помнить, что все элементы высоковольтной цепи должны быть смонтированы с учетом правил электробезопасности! Блок-схема установки для диэлектрофореза и электрослияния в однородном поле аналогична изображенной на рисунке (б). В качестве генератора Г\ используется генератор ГЗ-7А, снабженный ВЧ-трансформатором, повышающим напряжение вдвое (до 60 В). В качестве генератора Г2 — один из описанных выше формирователей.
