Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Ячейка представляет собой две чисто обработанные пластины из нержавеющей стали диаметром 40—50 мм, между которыми вложено изолирующее тефлоновое кольцо толщиной 0.5 мм с внутренним диаметром 30 мм. Пространство, заключенное между пластинами внутри кольца, образует рабочий объем ячейки. При необходимости ячейку можно стерилизовать любым способом и далее все операции выполнять, поместив ее и подводящие кабели в ламинарный шкаф.
Для слияния берут клетки, находящиеся по возможности в логарифмической фазе роста: 1) клетки А и Б смешивают в необходимой пропорции и, дважды промывая, переводят в 0.3 М раствор сахарозы, для увеличения индекса слияния клетки предварительно могут быть обработаны ферментами (см. метод 3.2) 3—10 мин при 37 °С;
2) каплю суспензии (50—100 мкл), содержащую 3- 106 клеток.
помещают на нижний электрод ячейки в центр кольца и накрывают верхним электродом (необходимо убедиться, что капля смачивает оба электрода); 3) диэлектрофорез клеток проводят в переменном поле: ?пик=0.8+1.2 кВ/см, /=1+2 МГц в течение 20—30 с; 4) непосредственно в ходе диэлектрофореза накладывают 1—2 импульса, ?=3+5 кВ/см, /=3+20 мкс, после чего продолжают диэлектрофорез еще в течение 10 с; 5) поле отключают и через 10 мин клетки переносят в питательную среду для культивирования.
При производстве мышиной гибридомы данным методом сплено-циты и миеломные клетки смешивают в соотношении 2:1. Обработке проназой (0.5 мг/мл, 0.5 мин, 37 °С) подвергают только миеломные клетки, затем их промывают 0.3 М сахарозой и после этого добавляют спленоциты [27]. Могут быть использованы следующие параметры диэлектрофореза: ?пик=1.2 кВ/см, /=2 МГц с последующим приложением одиночного импульса ?=4.2 кВ/см, /=3 мкс.
3.4. Электрослияние клеток в осадке после центрифугирования [28, 29]. Установка для слияния состоит из формирователя импульсов и ячейки (см. рисунок, е). В простейшем случае ячейка может быть изготовлена из стеклянной или пластиковой кюветы от спектрофотометра шириной 5—10 мм, на противоположные стенки которой приклеены электроды из алюминиевой фольги. Далее мы опишем процедуру слияния применительно к получению мышиных гибридом [29]: 1) клетки миеломы (1 • 107—3 • 107) и спленоциты (Ю8) смешивают, дважды промывают буфером с 0.28 М инозитом (см. метод 3.2, п. 1) и ресуспензируют в 4 мл того же буфера; 2) 0.4 мл суспензии помещают в кювету с приклеенными электродами; затем в качестве агглютинирующего агента добавляют ПЭГ (молекулярная масса 6000, «Serva») в концентрации 2—4 %; 3) кювету закрывают стерильной крышкой и центрифугируют при 200 g в течение 10 мин; таким образом, формируется тонкий клеточный осадок на дне кюветы;
4) подсоединив электроды к генератору, прикладывают 1—3 импульса; ?=2.5+5 кВ/см, /=5+100 мкс; 5) после электрообработки кювету помещают на 15 мин в термостат (37 °С), затем в кювету вводят 1.5 мл фосфатного буфера, содержащего 0.132 М NaCl (см. метод 3.2, п. 4) и далее инкубируют при той же температуре еще 10 мин; 6) клетки суспензируют в 10 мл среды МЕМ, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки, и затем разливают по 12 лункам 24-луночной культуральной платы.
3.5. Электрослияние клеток в монослое [30, 31]. В данном способе использовано свойство многих типов клеток (фибробластов, эпителиальных) образовывать монослой из плотно контактирующих клеток, спонтанно формирующиеся межклеточные контакты обеспечивают достаточно тесное сближение мембран и соответственно высокий индекс слияния: 1) исходные клетки А и Б смешивают в соотношении 1 : 1 и высевают в 35 мм чашки Петри («Falcon») или на покровные стекла, концентрацию клеток подбирают такой, чтобы на следующие сутки образовался смешанный субконфлюэнтный (70 %) монослой; 2) после формирования монослоя среду в чашке
заменяют на раствор следующего состава: 0.25 М сахароза, 0.01 М фосфатный буфер (К2НРО4/КН2РО4) и 1 • 10~3 М MgCl2; 3) в чашку Петри помещают два электрода (пластины из нержавеющей стали длиной 10—20 мм, скрепленные параллельно на расстоянии 4—10 мм друг от друга) и плотно прижимают их ко дну чашки; участок клеточного монослоя между электродами обрабатывают 3—5 импульсами, ?= 1-М.5 кВ/см, /=30-т-100 мкс; 4) чашку помещают в термостат (37 °С) на 10—20 мин, после чего среду электрообработки заменяют на полноценную ростовую среду с 15—20 % сыворотки и далее инкубируют в термостате в течение 3—5 ч; 5) появившиеся гетеро-и поликарионы можно наблюдать в фазовом контрасте или после фиксации и окрашивания клеток непосредственно в чашке Петри (или на стекле) через 3 ч после индукции слияния.
Методы селекции клеточных гибридов
В 60—70-х годах был предложен ряд систем селекции гибридных клеток, основанных на использовании для слияния линий клеток, имеющих генетические дефекты. Наибольшее распространение получила система с использованием среды ГАТ. В настоящее время система ГАТ используется в подавляющем большинстве работ по получению клонов гибридных клеток. В связи с необходимостью получения гибридов из первичных клеток большую важность приобретает разработка систем селекции клеточных гибридов, которые позволили бы обходиться без линий с генетическими маркерами [33, 34].
