Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
[И].
Автолнэат (45 мг) растворялся в 5,0 мл 0.03 М трис-НС1-буфера (pH 7,3) и
наносился на аф~ фииную колонку (200X25 мм), Для элюирования
использовался 0,03 М трис-НС1-буфер (pH 7,3): скорость потока 160 мл;ч;
объем фракции 10 мл. Гликан, пептид и фрагменты пеп-тидогликана выходили
в пике I, Тейхоевая кислота удерживалась на колонке. В момент, указанный
стрелкой, добавляли раствор 0.05 М а-метил-D глюкозы в 0,03 М трнс-НС1
(pH 7,3), и тейхоевая кислота выходила в виде пика II. / - оптическая
плотность при 280 им;
2 - содержание белка.
специфичности существуют большие различия. Например, лектин из семян
Lotus tetragonolobus характеризуется узкой специфичностью по ь-фукозе, в
то время как конканавалнн А из Catiava-На ensiformis обладает широкой
специфичностью и связывает большинство гликопротеинов из сыворотки крови
человека. В табл. 6.1 дана классификация лектинов по их основной
аффинности.
Примеры использования лектинов для выделения гликопротеинов и
гликопептидов даны в табл. 11.1. Два иммобилизованных лектина, а именно
лектин из Crotalaria juncea, специфичный для конфигурации галактозы (он
реагирует с углевода'ми и гликопро-
122
Глава 6
теинами, содержащими галактозу), и широко специфичный конка-навалин А,'
нашли применение при фракционировании сывороточных белков [19].
Известно, что конканавалин А взаимодействует с незащищенными a- d -
глюкопиранознльным, a-D-маннопираиозильным или P-d -фруктофуранозильным
остатками полисахаридов. Многие биологические мембраны содержат
глюкопротеины, структура и функции которых большей частью неизвестны.
Чтобы понять роль этих гликопротеинов в структуре мембран микросом,
Уинквнст и др. [66] выделили гликопротеины из мембран микросом печени на
сефарозе с присоединенным конканавалином А. На рис. 6.8 показано
использование этого специфического сорбента (конканавалин А - сефароза)
для выделения тейхоевой кислоты из автолизата клеточных мембран Bacillus
subtilis [14]. Упомянутая колонка имела более высокую емкость по
полисахаридам, чем по тейхоевой кислоте. При тех же условиях, при которых
сорбировалось ''-•60-70 мг тейхоевой кислоты, задерживалось на колонке
450 мг гликогена из печени кролика. Использование иммобилизованного
конканавалина А для выделения клеток рассмотрено в разд. 6.10.
6.5. ВЫДЕЛЕНИЕ РЕЦЕПТОРОВ. СВЯЗЫВАНИЕ И ТРАНСПОРТ БЕЛКОВ
Главное действие некоторых гормонов направлено на плазматическую мембрану
клеток-мишеней. Под термином "рецептор" обычно понимают компоненты
плазматических мембран, которые вовлечены во взаимодействие с данным
гормоном. Они, по-видимому, локализованы исключительно на поверхности
мембранных клеток. Для того чтобы 'выяснить действие гормонов на
молекулярном уровне, необходимо очистить и идентифицировать эти
специфические мембранные рецепторные структуры, количество которых в
тканях очень мало по сравнению с другим присутствующим материалом.
Например, концентрация рецептора глюка-гона в мембранах клеток печени
.очень низка и составляет 2,6 нмоль в 1 мг белка [30]. При столь малых
количествах взаимодействие с иммобилизованными гормонами должно быть
очень эффективным, чтобы обеспечить прочное связывание крупных мембранных
фрагментов. Взаимодействие гормонов с их комплементарными рецепторами
специфично и характеризуется высоким сродством. Константа диссоциации для
глюкагона равна 10-9-1СИ° моль/л, для инсулина-5-10_п моль/л, а для
норэпи-нефрина-10"6-10~7 моль/л [-35]. Очень трудно выделять такие малые
количества стандартными методами. Использование био-специфической
хроматографии на высокоэффективных иммобилизованных рецепторах позволяет
избирательно концентрировать
Выбор аффинных лигандов
123
такие небольшие количества и выделять с относительно высоким выходом.
Хотя технические трудности, связанные с разработкой подходящих методов
определения рецепторной активности, и трудности солюбилизации долгое
время мешали развитию методов очистки
Рис. 6.9. Аффинная хроматография солюбилизированных детергентом
рецепторов инсулина мембран клеток печени на аффинных колонках,
содержащих ди-аминодинропиламиносукциннл-М-фенилаланил-инсулин-агарозу
[8].
I очогсннзнровипныс мембраны клегох печени экстрагировались 2%-ным (но
объему) трито-J104 Х-100 путем встряхивания при 24 'С в течение 40 ыни;
затем гм оси центрифугировались. Проводился ди:ииз супериашнта в течение
!Ь ч при 4 °С против гидрикарбпматно!о буфера К рсбса - Рин г ер а (pH
7,4), п-л ржашечо 0.1 об % тритона X 100. Затем 12 мл супернатанта при 24
°С очень медленно Пропускались черп аффинную; колонку (пастеровскую
пинетку Vf =1*3 мл), которая предвари ¦ глыю проминалась в течскн, JH ч
0.1 М NaHCO.i буфером (pH 8,4) и уравновешивалась (2 ч) гндрокири-шатным
буфером Кребса-Рннгера, содержа Шим 0.1 об, тритона Х-100 Колонка
"исчерпывающе" щчшывалась (разрыв иа абсцжег) перед элюированием
(стрелкой 0.05 М N.i ацетатным б\фсром (pH <V,fi), содержащим
1.5 моль л мочевины н 0,1 об тритона X-IU0. После иаш-ссння этого
