Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
охарактеризованы, потому что эти лиганды присоединяются к носителю
определенными функциональными группами. Для улучшения стериче-
108
Глава €
ской доступности этих лигандов вводит пространственную группу, в
большинстве случаев между ними и поверхностью нерастворимого носителя. В
качестве высокомолекулярных аффинных лигандов используются
преимущественно белки или нуклеиновые кислоты, которые часто подвержены
денатурации, приводящей к необратимой потере активности, и для них обычно
метод присоединения к носителю не дает возможности точно знать место
привязки.
6.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ, ИНГИБИТОРОВ
И КОФАКТОРОВ
Аффинными лигандами для выделения ферментов могут быть конкурентные
ингибиторы, субстраты и их аналоги, продукты, кофакторы и аллостерические
эффекторы, а также антитела или соединения, которые содержат ионы
металлов или SH-группы, (см. табл. 11.1).
В качестве примера использования конкурентного ингибитора
на рис. 6.2 показано выделение химотрипсина из неочищенного экстракта
поджелудочной железы; в качестве специфического сорбента использован Ы-
бензилоксикарбонилглицил-о-фенилала-нин, присоединенный к сферону через
гексаметилендиамин [55]. ¦Элюирование фермента осуществлялось либо путем
изменения pH (рис. 6.2, а), либо специфически раствором конкурентного
ингибитора трипсина (рис. 6.2, б). Для того чтобы получить химогрип-син
из его комплекса с растворимым ингибитором трипсина, необходимо
дополнительно использовать гель-хроматографию в кислой среде. Результаты
(количество и активность химотрипсина) фактически совпадают с
результатами, получаемыми при простом лиофильном высушивании материала из
пика 2 (рис. 6,2, а).
Для многих ферментов, которые специфичны к ДНК и субстратом которых
является однонитевая ДНК, последняя может быть иопользоаана в качестве
аффинного лиганда (см, табл. 11,1). Очень эффективным является, например,
сорбент ДНК - агароза [49]. Этот сорбент характеризуется высокой
концентрацией ДНК> и неспецифическая сорбция на нем может быть сведена до
минимума выбором подходящих условий. На рис. 10.9 приведен пример
использования ДНК-агарозы для выделения РНК -полимеразы. Другими
примерами использования субстратов для выделения ферментов является
аффинная хроматография цитохромо-ксидазы на сефарозе с иммобилизованным
цитохромом с [44] и протоколлаге-пролингидроксилазы на биогеле А с
восстановленным и карбоксиметилированным коллагенов [4]. В очень многих
реакциях, катализируемых ферментами, функцию косубстратов выполняют
коферменты. Такие ферменты должны содержать по
Выбор аффинных лигандов
109
меньшей мере два специфических связывающих участка - один для кофермента,
не являющийся общим для всех лигандов, и один или несколько для
субстрата. Последний центр связывания, следовательно, должен определяться
природой субстрата и катализируемой реакцией. Поэтому иммобилизованные
коферменты
Рис. 6.2. Хроматография неочищенного панкреатического экстракта на 2-Gly-
D-
Phe-NH2 - сфероне [55].
Образцы по 100 мг активного панкреатического экстракта наносились на
колонку (60X15 мм): для элюирования использовались водные растворы
формиата аммония (0,05 М муравьиная кислота + 25%-ный аммиак до pH 8.0),
Объем фракции 6 мл; фракции отбирались с интервалами 20 мин. Оптическая
плотность: 1 - примесей н трипсина; 2 - химотрипсина;
3- комплекса химотрипсина с ингибитором трипсина из легких. Стрелка
указывает: а - начало изменения pH от 8,0 до 3,5 {0.1 М раствор
муравьиной кислоты, pH которой был доведен до 3.5 при помощи аммиака);
для наглядности это же изображено пунктиром; б - введение 20 мг
ингибитора трипсина в 5 мл водного раствора формиата аммония,
обязаны избирательно сорбировать такие группы ферментов, которые
катализируют дву- и многосу<5стратные реакции.
Двусубстратные ферментативные реакции могут иметь два механизма [35]:
I) двусубстратные с вынужденным (упорядоченным) механизмом
А В р q
I I ¦ *
Е ЕА ЕАВ ?=* EPq EQ Е
no
Глава 6
2) двусубстратные с неупорядоченным механизмом
А(В)
4
8(A)
4
Р(Ч)
t
Q(P)
t
Е ЕА(В)
ЕАВ EPQ
EQ(P) Е
где Е - фермент, а А, В, Р и Q - реагенты или продукты.
В упорядоченном механизме лиганд А вынужден связываться раньше, чем
лиганд В сможет реагировать с образовавшимся двойным комплексом.
В неупорядоченном механизме лиганды А и В могут связываться независимо
друг от друга в любом порядке. В этом случае выбор лиганда определяется
сродством фермента и относительной легкостью иммобилизации.
Для упорядоченного механизма иммобилизация лиганда А подвержена обычным
ограничениям аффинной хроматографии. В этом случае иммобилизация лиганда
В не приводит к конкурентному сорбенту для комплементарной молекулы;
исключение составляют случаи, когда лиганд А присутствует в рабочем
буферном растворе, в котором наносят фермент на колонку. Таким образом,
присутствие лиганда А является необходимым для связывания сорбентом
ферментов, поскольку лиганд В связывает двойной комплекс лиганд А -
