Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
элюента указано стрелками). Измерялась радиоактивность каждой фракции
(объем фракции 0*5- к мл), / - содержание 12ь1 в мембранах печени; 2 -
радиоактивность элюата.
Аффинная хроматография токсина из Vibrio cholerae, меченого 1251, на
агарозе с присоединенным фетуином или на ганглиозид -
диаминопропиламиноагарозе [45] показана на рис. 6.15. Агароза с
присоединенными ганглиозидами может быть использована также для очистки
других токсических белков, таких, как ботулин или столбнячный токсин,
который, как известно, также образует прочные комплексы со свободными
ганглиозидами.
Присутствие генных регуляторных белков в низких концентрациях- типичное
явление; кроме того, для этих белков, как правило, неизвестны методы их
обнаружения. Регуляторный белок ага С (из оперона L-арабинозы) выделен
Уилкоксом и Клемент-
Выбор аффинных лигандов
135
соном [65] на сефарозе с присоединенным 4-[4-(4-аминофеиил)-
бутанамидо]фенил-р-0'фукопиранозидом. Примеры аффинных лигандов для
других соединений приведены в табл. 11.1.
6.10. ВЫДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК И ВИРУСОВ
Разделение клеток, основанное на их аффинности к специфическим носителям,
преимущественно к гранулированным, покрытым биоспецифическим реагентом,
используется в различных сис-
Рис, €.16. Схема фракционирования на волокнах в общем виде 116].
темах. Вещества, обладающие необходимой специфичностью, такие, как
антигены, антитела, лектины и гормоны, либо адсорбируются на этих
носителях, либо ковалентно связываются. В табл. 11.1 приведены примеры
выделения клеток и используемые для этого аффинные лиганды.
Аффинное фракционирование клеток наиболее часто применяется в анализе
популяций лимфоидных клеток. Мэтьюз и др. [36] разработали метод
разделения лимфоидных клеток из селезенки и тимуса крысы и селезенки мыши
на сефарозе с прикрепленным и ней агрегированным иммуноглобулином крысы.
При фракционировании клеток на волокнах [16] используется способность
этих клеток специфически связываться с натянутыми
136
Глава 6
волокнами, модифицированными подходящими молекулами, такими, как
антигены, антитела и лектины. Очень простым, эффективным и дешевым
устройством для такого фракционирования является чашка Петри, в которую
помещается полиэтиленовая рамка с натянутыми нейлоновыми волокнами (длина
самых длинных волоко-н достигает 2,5 см). Это устройство позволяет
преодолеть
Рис, 6.17. Связывание эритроцитов (/) и тимоцитов (2) различными
волокнами в зависимости от числа молекул конканавалина А на I см
найлонового волокна [16].
2¦ клеток в 4 мл фосфатного буфера с солью инкубировали с различными
волокнами в те*
чение 120 мнн при перемешивании в стандартных условиях. Число связанных
клеток определялось микроскопическим исследованием 1 мм сегментов
волокна.
многие трудности, которые возникают при разделениях клеток на колонках.
Фракционирование достигается либо благодаря специфическому связыванию
отдельного компонента на поверхности клетки, либо вследствие различий в
сродстве, либо в результате неодинакового количества рецепторов с похожей
специфичностью на поверхности клетки и неодинакового их .распределения.
Основной принцип фракционирования с помощью волокон показан на рис. 6.16.
Подходящие для этой цели молекулы или макромолекулы присоединены
соответствующим химическим способом к нейлоновым волокнам, натянутым на
рамку. Диссоциирующие клетки отделяют встряхиванием волокон в подходящей
для диссоциации среде, а несорбированные клетки отмывают. Связанные
клетки могут быть затем перенесены на волокнах в другую среду и в
дальнейшем охарактеризованы или их можно получить в свободном виде в
среде путем снятия их с натянутого волокна
Выбор аффинных лигандов
137
с помощью иголки (отщепление в точках их прикрепления к волокну) .
Аффинные лиганды можно присоединять к волокнам также посредством
специальных связей, что позволяет освобождать клетки путем химического
'Или ферментативного расщепления этих связей. На рис. 6.17 показано
связывание эритроцитов и тимоци-тов на различных волокнах в зависимости
от числа молекул кон-канавалина А на 1 см найлонового волокна.
В табл. 11.1 приведено также несколько примеров выделения вирусов.
Наиболее часто используемыми аффинными лигандами являются связанные
антитела, например выделение вируса алле-утской болезни на сефарозе с
присоединенным иммуноглобулином IgG из хронически инфицированных норок
[67].
6.11. ПРОДАЖНЫЕ НЕРАСТВОРИМЫЕ АФФИННЫЕ СОРБЕНТЫ
Развитие аффинной хроматографии сопровождается увеличением количества
продажных иммобилизованных аффинных лигандов. Для составления общей
картины о применении некоторых веществ в практике аффинной хроматографии
в табл. 11.1 перечислены промышленные названия носителей и
иммобилизованных аффинных лигандов. Из цитированной в таблице литературы
очевидно, что в настоящее время очень возросло применение продажных
иммобилизованных аффинных лигандов, например конкана-валнна А, связанного
с сефарозой (кон А - сефароза). Можно полагать, что то же ожидает и
