Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
к набуханию к нему добавлены лактоза
142
Глава 6
и декстрин. Через I год хранения лиофильно сухого порошка при
температурах <8°С теряется ~2% нуклеотидного материала. Однако это
происходит в результате отщепления мономера от полимера, а не отщепления
аффинного лиганда от матрицы.
Для выделения транспортной РНК и синтетически защищенных олигонуклеотидов
используют БД-сефадекс. Это липофильное производное ДЭАЭ-сефадекса А-25,
полученное бензоилировани-ем, соответствует ~5 мэкв. бензоильных групп на
1 г сухого геля. Емкость по тРНК составляет ~20 мг на 1 мл объема
колонки. Поскольку при экстремальных pH возможен гидролиз эфирных связей
ароматических групп с матрицей, фирма рекомендует непосредственно перед
использованием проводить промывку сорбента.
Для гидрофобной хроматографии производится октилсефароза CL-4B и
фенилсефароза CL-4B. Октильная или фенильная группы вводятся в матрицу
при взаимодействии сефарозы с соответствующим глицидиловым эфиром, т. е.
с помощью незаряженной химически устойчивой эфирной связи. Концентрации
связанных лигандов приблизительно равны для обоих гелей и составляют 40
мкмоль на 1 мл геля, что соответствует степени замещения ~0,2 моль
гидрофобного заместителя на I моль галактозы. Связывающие способности
геля зависят от экспериментальных условий и природы выделяемых белков.
Для обоих гелей в 0,01 М фосфатном буферном растворе (pH 6,8), содержащем
1 моль/л сульфата аммония, 1 мл геля связывает ~15-20 мг сывороточного
альбумина человека (молекулярная масса 68 000) или 3- 6 мг р-
лакгоглобулина (молекулярная масса 18 000). Октилсефароза CL-4B и
фенилсефароза поставляются в виде суспензии, стерилизованной
диэтилпирокар'бонатом, с добавкой 0,02% азида натрия. Суспензия
октильного производного содержит также 25% спирта. Поскольку сорбенты
приготовлены на основе сефарозы CL-4B, сшитой 2,3-дибромпропанолом и
десульфированной, гели обладают очень хорошими свойствами, главными из
которых являются высокая химическая *и физическая устойчивость. Оии
устойчивы к денатурирующим агентам, таким, как мочевина и гуанидинхлорид,
и могут быть использованы в органических растворителях и ионных и
неионных детергентах. Фирма рекомендует хранить гели в виде суспензии в
холодильнике при температурах <8°С, не прибегая к лиофильному
высушиванию.
Большие количества иммобилизованных аффинных лигандов производятся также
фирмой PL Biochemicals (табл. 6.5). Часто аффинный лиганд можно связать с
матрицей несколькими способами; в табл. 6.5 приведены типы связывания,
указывающие метод присоединения.
Тип 1. Связь образована при взаимодействии матрицы, которая может иметь
или не иметь пространственную группу, непо-
Выбор аффинных лигандов
143
средственно с аффинным лигандом с использованием сшивающего агента,
такого, как карбодиимид. Специфическая точка связывания неизвестна [38].
Тип 2. Связь образована с Ы6-аминогруппой аденозннового кольца [24].
Тип 3. Связь образована с Соположением аденинового кольца [24, 64].
Тип 4. Связь образована с гидроксильной группой рибозы [31].
Тип 5. Связь образована с меркаптогруипой лиганда [9].
Тип 6. Связь образуется по реакции аффинного лиганда с активированной
бромцианом агарозой. Природа связи неизвестна [32, 59].
Тип 7. Связь образуется с концевым фосфатом нуклеотида обычно в виде
фосфодиэфирной связи [21].
Ферменты, связанные с энзакрилами, выпускаются фирмой Koch-Light Labs, и
включают а-амилазу, каталазу, а-химотрипсин, декстраназу,
глюкозооксидазу, трипсин, уреазу и уриказу.
Олигодезокситимидиловую кислоту (содержит 10-- 12 оснований), связанную с
целлюлозой, производит под названием олиго (dT)-целлюлоза Т2 и олиго(бТ)-
целлюлоза ТЗ фирма Collaborative Research. Три сорта этого сорбента
испытаны Бантлем и сотр. [3]; определялась адсорбционная емкость этих
сорбентов по РНК из Escherichia coli. Олиго(бТ)-целлюлоза Т2 имеет
наименьшую емкость и наиболее высокой базовый "шум" (по по-ли(А)-РНК);
связывающая емкость препарата олиго(dT)- целлюлоза ТЗ в 2-5 раз выше, а
неспецифическая сорбция ниже, чем у первого. Самым низким неопецифическим
связыванием характеризуется олиго (dT)-целлюлоза T3I, который является
олиго (dT)-целлюлозой, приготовленной из целлюлозы ватман CF11, промытой
по методу Албертса и Геррика [1]. Олиго (dT)- целлюлоза ТЗ и олиго (dT)-
целлюлоза T3I производятся фирмой Collaborative Research. Специфичность
олиго (dT)-целлюлозы ТЗ, оцениваемая по связыванию молекул, содержащих
поли-адениловую кислоту, приведена в табл. 6.6 [3].
Целлюлоза в качестве носителя для аффинных лигандов поставляется также
фирмой Merck. Для выделения ряда протеиназ к сукцинилированной
аминододецилцеллюлозе присоединяют 4-ам'ннобензамидин (90-110 мкмоль на 1
мл объема колонки), при этом объем сорбента в колонке составляет 1,2-1,4
мл на 1 г влажного сорбента. Для выделения протеиназ используют и другой
иммобилизованный ингибитор, а именно ингибитор трипсина Кунитца из соевых
