Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
основанного на использовании хелатных гелей, содержащих эти ионы, Порат и
др. [48] ввели термин "ме-таллохелатная аффинная хроматография". Этот
метод детально рассмотрен в разд. 7.6.
126
Глава 6
Рис. 6.10. Выделение SH протеиназы ид неочищенного экстракта бобов на ок-
сиа.ткнлметакрилатном геле, содержащем 15% метакриланилида [57].
Колонка 100X10 мм. Объем фракции S мл, интервал отбора фракций 15 мин.
Состав стан дартного б>ферного раствора; 0,5% "ный бутанол+10% ный
днметилсульфокснд-МК1 .4 KCl+0,0.5 М СНэСООЫа. Элюирующий буферный
раствор готовился из стандартного буферного раствора, в который
добавлялось 0,5 ммоль'л HgClj.
6.7. ВЫДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ
Если определяемые аминокислоты расположены в активном центре или на
поверхности белковой молекулы, успешно используется химическая
модификация белков с последующим выделением меченых пептидов. Однако
выделение пептидов, содержащих модифицированный остаток, достигается не
легко главным образом потому, что модифицирующий реагент часто реагирует
с другими остатками, давая продукты с различными выходами. По этой
причине гидролизат белка содержит несколько модифицированных пептидов,
каждый из которых присутствует в количествах, меньших эквимолярных по
отношению к белку. Традиционные методы выделения пептидов включают
трудоемкие и длительные операции, каждая стадия которых обычно
значительно снижает конечный выход пептида. Использование аффинной
хроматографии на сорбенте, специфичном к модифицирующему реагенту,
позволяет в одну стадию выделить модифицированный пептид. Вилчек [62]
различает три категории модификаций белков:
1) направленная модификация или аффинное введение метки в остатки
активного центра белка;
Выбор аффинных лигандов
12:
2) избирательная модификация одного или нескольких остат ков,
обусловленная сверхвысокой реакционной способностью ил'т локализацией на
поверхности белка;
3) полная модификация всех боковых цепей определенны:, аминокислот
специфическим для данной группы реагентом ( целью определения
аминокислотной последовательности.
К первой категории относятся реакции субстратных аналогов с
аминокислотами в активном центре фермента или реакция ran-
разворачивание
I Белок
аффинная
хроматография
¦*г
Рис. 6-11, Общая схема выделения мечепьгх пептидов из аффинно-меченого
белка [62].
тена в активных центрах антител. В этих случаях за специфическим и
обратимым связыванием аналогов в связывающем центре белка следует
образование ковалентной связи по (или вблизи) аффинному центру. На рис.
6.11 приведена общая схема выделения меченых пептидов из аффинно-меченого
белка. Нативный белок (фермент или антитело), ковалентно связанный с -
нерастворимым носителем, сорбирует из гидролизата того же аффинно-
меченого белка только аффинно-меченый пептид. После промывки колонки
специфически сорбированный меченый пептид можно элюировать, если создать
такие условия, когда он диссоциирует. Вилчек [61] использовал этот метод
для выделения аффинно-меченых пептидов из стафилококковой нуклеазы после
реакции с бромацетильным производным дезокситимидин-З'-п-аминофенил-
фосфат-5'^фосфата и с бромацетил-я-аминофенилфосфатом, На рис. 6.12
приведены результаты аффинной хроматографии меченых пептидов из
триптического гидролизата модифицированной нуклеазы на нуклеаза -
сефарозе. В табл. 11.1 даны также другие примеры выделения аффинно-
меченых пептидов.
Специфические антитела с высоким сродством могут быть получены почти ко
всем небольшим молекулам. Полученные таким
128
Глава 6
образом специфические антитела, будучи ковалентно связанными с
нерастворимым носителем, представляют подходящие специфические сорбенты
для пептидов, которые содержат соответствующие небольшие молекулы.
Примером такого рода является выделение нитротирозилсодержащих пептидов
из триптического гидро-
Рис. 6.12. Аффинная хроматография на колонке с нуклеаза-сефарозой аффин-
но-меченных реагентами lull пептидов [61].
Колонки (20x5 мм уравновешивались 0,05 М бораткым буфером (pH 8,0),
содержащим 10 ммоль/л СаС12. Триптические гидролизаты модифицированной
нуклеазы (1,7 мг) наносились в 0,5 мл того же буфера. После пропускания
через колонку 10 мл буфера связавшиеся пептиды элюировались раствором
аммиака (pH 11,0); начало элюирования указано стрелкой. / - оптическая
плотность при 280 нм; 2 - радиоактивность.
лизата нитротирозил-лизоцима [26] с использованием в качестве аффинного
сорбента антител к нитротирозильному остатку, прикрепленных к сефарозе.
Если ферментативный гидролизат нитрованного белка пропустить через
колонку, содержащую укрепленные антитела к нитротирозину, все пептиды
(кроме тех, которые содержат нитротирозин) выйдут в первом пике. Пептиды
нитротирозина элюируются затем 1 М. аммиаком. Описанную методику можно
использовать в исследованиях топографии белка, имеющих целью определение
тирозиновых остатков, расположенных на поверхности молекулы.
После появления секвенатора время анализа аминокислотной
