Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
последовательности белка стало определяться стадией очистки
Выбор аффинных лигандов
129
Таблица 6.2
Использование анти-ДНФ-антител для выделения пептидов
Аыинонислота Реагент RX Условия Продукты
Цистеин no? no?-^~^-nh(CH?)^ch-соон NHCOCHgBr no? NOjp^^-F pH 7,5 ;
Jv, 25°C pH 5; 14, 25 °C -nh-ch-co-nh- 1 СН5 s I t R
Метионин NC^^-NHfCHa)-CH-COOH NHCOCHgBr 24 4; 25°С; 8 M мочевина pH
3,5 -nh-ch-co-nh- 1 CH* 1 * CHj 1 CH3
Триптофан no2 NO^SCl 50%-на.я уксусная кислота, 1ч 2i°C -NH-CH-CO-
NH- 1 снг CXX
Гистидин Лизин noe no?-/ VnH(CH?)^CH-COOH nhcoch?i N°3 NO^SO,. pH 5;
24ч; 25°C pH 5; 24 ч; 25°C -NH-CH-CO-NH - I CH* Hv RN^NH -NH-CH-CO-NH-
NH 1 R
пептидов. Разработка чувствительных и эффективных методов избирательного
выделения модифицированных пептидов создает возможность для получения
даже очень небольших количеств пептидов из белков, недоступных в больших
количествах (рецеп-
9-6
130
Глава 6
торы, транспортные белки и т. д.). В табл. 6.2 даны примеры использования
антидинитрофенильных антител для выделения пептидов, содержащих остатки
цистеина, метионина, триптофана, гистидина и лизина [62].
Аффинная хроматография S-пептида и S-белка, образованных в результате
протеолитического расщепления бычьей панкреатической рибонуклеазы,
обсуждалась в разд. 4.4. Хроматография может даже быть использована для
очистки синтетических аналогов S-пептидов (см. табл. 11.1), Выделение
пептидов, содержащих свободную SH-группу, рассматривалось в разд. 6.6.
6.8. ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И НУКЛЕОТИДОВ
Мононуклеотиды, олигонуклеотиды и нуклеиновые кислоты, ковалентно
связанные с инертными матрицами, пригодны как для целей выделения, так и
для исследования физико-химических
Время удерживания, мин
Рис. €.13. Хроматограммы смеси пяти оснований нуклеиновых кислот (о) н
пяти нуклеозидов (б), полученные на
смоле, содержащей 8,0 (а) и 16,4% (б) связанного тимина [28].
Пористая сферическая смола синтезирована полимеризацией суспензии
глициднлметакри* лата в присутствии разбавителя, ПрисОСДнне* нне тнмниа к
полученной таким образом смо-ле проводилось в днметнлформамнде при 65 °С
в присутствии карбоната калия. Хроматография проводилась в колонке
(610X7*6 ММ) из нержавеющей стали при 25 °С на жидкостном хроматографе
высокого разрешения (HLO802U, фирмы Toyo Soda Manufacturing Co.h в
качестве растворителя использовалась дистиллированная вода. Элюат из
колонки фотометрн-ровался при 254 им. а - скорость потока
3,5 кл/мнн при давлении 45 кг/см2; б - размер частиц смолы 15*20 икм;
скорость потока 3.1 мл/мин; температура 30 *С.
свойств нуклеиновых кислот и ферментов, принимающих участие в их синтезе
и .разрушении.
Иммобилизованные основания нуклеиновых кислот, нуклеози-ды или
олигонуклеотиды можно использовать при разделении, фракционировании и
определении структуры различных нуклеиновых кислот. Примером может
служить изучение последовательности нуклеиновых кислот, приведенное
Гиламом и Робинсоном [22]. Они, например, разделили гептануклеотиды на
колонке с тимидин-полинуклеотид - целлюлозой. Хроматография на ДНК -
целлюлозе рассмотрена в обзоре Албертса и Геррика [1]. На
Выбор аффинных лигандов
131
рис. 6.13 показано разделение оснований нуклеиновых кислот и нуклеозидов
высокоэффективной аффинной хроматографией .с
использованием колонки, наполненной пористой сферической смолой диаметром
12-15 мкм, содержащей присоединенный тимин [28].
Многие информационные РНК животных и вирусов богаты полиадениловой
кислотой. Часто это может быть использовано
Номер фракции
Рис. 6.14, Хроматография РНК ретикулоцитов утки на олигодезокситимидилат-
целлюлозе [46].
Колонка (40X5 мм) уравновешивалась раствором 0,5 М NaCl+0,5%-ный
додецнлеульфат на-трня+0,01 М трис буфер (pH 7,5) (начальный буфер).
Образцы растворялись в воде, затем разбавлялись равным объемом начального
буфере, вдвое более концентрированного, и наносились на колонку. Колонка
промывалась -30 мл начального буфера н затем элюировалась раствором
0,5%'Ный додецнлеульфат натрия+0,01 М трнс-буфер (pH 7,5). После до*
бавления начального буфера к образцам все операции проводились при
комнатной температуре, РНК осаждалась при 20 °С нз раствора, содержащего
0,1 моль/л NaCl, добавлением
двух объемов спирта.
(см. табл. 11.1) для выделения их хроматографией ка носителях, содержащих
олиготимидиловую кислоту. На рис. 6.14 в качестве примера показана
хроматография РНК из ретикулоцитов утки на целлюлозе с присоединенной
олиготимидиловой кислотой [46]. Около 94-96% РНК элюируется в первом
пике, и элюат содержит рибосомальную и транспортную РНК. Элюат во втором
пике содержит кроме рибосомальной РНК информационную РНК 10S глобина. На
основании анализа индивидуальных пиков центрифу-
9'
132
Глава 6
Таблица 6.3
Емкость колонки по связыванию гомополимеров с различными целлюлозами
и их производными
Колонка Полнадепнловая ! кислота3, Дгео | на 100 мг целлюлозы По
линнозиновая кислота6. Дам на 100 мг целлюлозы ¦ Полиуридиновая
