Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
элюзтов при 280 нм; 2 - активность ингибитора; 3- изменение pH, Стрелки
указывают замену элюирующего 0,2 М. триС'НС1-буфера с pH 8,0 на другой
10,2 М (KCI + HCI)] с pH 2,0.
репленным химотрипсином (рис. 6.5, б) с аналогичной хроматографией на
немодифицированном сфероне (рис. 6.5, а). Хроматография на
немодифицированном сфероне проводилась для того, чтобы контролировать,
что в данных экспериментальных условиях не наблюдается элюирования
материала, иеспецифически сорбированного на нерастворимом носителе [56].
Если ингибитор содержит концевые гликозильные группы, для его выделения
может быть использован конканавалин А. Примером является выделение
арантитрипсина из сыворотки крови человека на сефарозе с присоединенным
конканавалином А [40]. Майеровиц и др. [41, 42] получили значительно
обогащен-
8-6
114
Глава 6
ный арантитри'псином продукт из человеческой и мышиной сыворотки крови
путем удаления загрязняющего продукт альбумина иммуносорбцией на сефарозе
с укрепленными антителами к альбумину.
6.3. ИММУНОАФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Взаимодействие антител с их антигенами сравнимо по специфичности со
связыванием субстратов с ферментами. Константы диссоциации комплексов,
как правило, находятся б интервале 10-5-10-8 моль/л [39]. Для выделения
антител используются антигены или гаптены (химически модифицированные
группы, выступающие в роли иммуноагентов после их присоединения к белкам
или синтетическим .полипептидам), против которых эти антитела получены. В
табл. 11,] даны многочисленные примеры.
Антитела, индуцируемые определенными антигенами, характеризуются
значительной гетерогенностью. При использовании простых химически
определенных гаптенов причины для такой гетерогенности могут быть
следующими [35];
1. Гаптены могут быть присоединены к различным частям молекулы-носителя и
поэтому иметь различное микроокружение. Такая возможность исключается,
если используются белки-носители, содержащие единственную аминокислоту,
способную вступать в реакцию связывания, или используется синтетический
полипептид, содержащий аминокислоту одного типа.
2. Гатттен может быть ориентирован различными способами относительно
поверхности молекулы антигена.
3. Антитела могут быть нацелены против различных частей молекулы гаптена.
С антителами против белков ситуация еще более сложная, потому что белок
содержит различные антигенные группы, которые еще менее определенны, чем
в случае простых гаптенов. Более того, сыворотка содержит несколько
классов белков с активностью антител, такие, как иммуноглобулины IgG, IgM
и IgA.
Гетерогенность участков связывания в антителах приводит к набору констант
диссоциации для комбинаций антиген - антитело. При иммобилизации антигена
на нерастворимом носителе образуется специфический иммуносорбент, который
должен обладать следующими свойствами:
1) способностью адсорбировать комплементарное антитело из смеси
компонентов;
2) освобождать адсорбированное антитело из комплекса со специфическим
сорбентом количественно в условиях, безвредных для специфической
активности антитела;
3) высокой адсорбционной емкостью по специфическому антителу;
Выбор аффинных лигандов
115
4) сохранять свою биологическую активность после повторного использования
и хранения;
5) обладать подходящими механическими свойствами, позволяющими
центрифугировать, фильтровать и наполнять колонки.
Удовлетворение этим требованиям зависит не только от качества и
количества связанного антитела, но также от природы нерастворимого
носителя и природы связи.
Рис. 6.6. Очистка интерферона лейкоцитов человека (2,3-10(r) ед.) ка
колонке (110X20 мм) с антителами к интерферону лейкоцитов [2].
После загрузки образца колонка промывалась солевым раствором в фосфатном
буфере, а затем фосфатцитратным буфером Макилвайна (pH 3,8). содержащим
500 мкг/мл цнтохрома с, Интерферон элюировался в градиенте pH, начало
наложения градиента указано стрелкой. Около 80% активности интерферона
собрано в двух пиках, / - пропускание; 2 - содержание
интерферона: 3 - изменение pH.
Если в ходе выделения антител к глюкагону на сефарозе с укрепленным
глюкагоном [39] иа колонку наносили сыворотку с низким титром (200-300),
активные антитела элюировали 0,15 М. хлоридом натрия, доведенным до pH 11
водным аммиаком, либо одноступенчато, либо в градиенте. Полное отделение
от неспецифически сорбированных белков достигалось только в последнем
случае. Если титр антисыворотки ~700, освобождение антител из колонки
происходило только после пропускания через нее 0,15 М хлорида натрия с pH
11 в объеме, равным 30 объемам колонки. Если титр наносимой антисыворотки
~1000, антитела нельзя элюировать даже 100-кратным (относительно объема
колонки) объемом 0,15 М хлорида натрия (pH 11), и антитела сходят с
колонки с фронтом растворителя только при пропускании 0,1 М уксусной
кислоты, pH которой доведен до 2,2 муравьиной кислотой. Однако если титр
наносимой антисыворотки был в ин-
