Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Туркова Я. -> "Аффинная хроматография" -> 39

Аффинная хроматография - Туркова Я.

Туркова Я. Аффинная хроматография — М.: Мир, 1980. — 472 c.
Скачать (прямая ссылка): afinnayahromatografiya 1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 33 34 35 36 37 38 < 39 > 40 41 42 43 44 45 .. 198 >> Следующая

на геле перед
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
101
элюированием. На адсорбцию фермента не оказывают заметного влияния
высокие концентрации хлористого калия, фермент элюируется исключительно с
помощью 2 мМ NAD+, если элюирующий буферный раствор содержит 0,2 моль/л
соли. В таких условиях фермент не сорбируется ни на носителе с
прикрепленной пространственной группой, ни на биосорбенте после замены в
нем лиганда NAD+ на группу NADP+. Из этих результатов следует, что по
своей природе сорбция является биоспецифической. Предполагается, что
снижение количества элюируемого фермента при увеличении времени его
контакта со специфическим сорбентом обусловлено небиоспецифической
адсорбцией на гидрофобной пространственной "ножке", которое происходит
после первоначального биоспецифического связывания на иммобилизованном
NAD+. Корректность этой гипотезы подтверждается данными, полученными с
аффинным сорбентом, у которого гидрофобная пространственная группа была
заменена гидрофильной. Сорбент, приготовленный таким образом, сохранял
свою высокую аффинность к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе и при
элюировании раствором NAD+ выход фермента был выше 90%, причем он почти
не снижался, даже если перед элюированием колонка с сорбированным
ферментом была оставлена на 1,5 ч. Такой эксперимент, проведенный с
ферментом, сорбированным на носителе с гидрофобной пространственной
группой, приводит только к ~ 10%-ному выходу фермента, элюируемого NAD+.
Хотя небиоспецифическая адсорбция [26] в общем нежелательна в аффинной
хроматографии, описано много примеров, в которых такая сорбция приносила
пользу, повышая аффинность слабых биоаффинных систем. В таких случаях
подходящий выбор и тщательный контроль условий могут сохранить
преобладание биоспецифической природы взаимодействия, должным образом
усиленной небиоспеиифическим взаимодействием, так что последнее не
становится доминирующим. Такая "усиленная" биоаффинность очень близка
специфической высокой биоаффинности, и фермент может быть элюирован
только другим биоспецифическим лигандом. Для этого эффекта О'Карра и др.
[26] ввели термин "составная аффинность".
Таким образом, многие факторы влияют на взаимодействие иммобилизованного
лиганда с комплементарной молекулой. Как биоспецифическая, так и
небиоспецифическая сорбция основана по сути дела на тех же
электростатических и гидрофобных взаимодействиях и их комбинации. Вклад
небиоспецифических взаимодействий можно лучше оценить, сопоставляя
константы диссоциации комплекса выделяемой макромолекулы с
иммобилизованным аффинным лигандом и с тем же лигандом в растворе,
используемом для элюирования (гл. 4). Такая характеристика аффинной
системы весьма необходима, особенно если аффинная
102
Глава 5
хроматография используется не только для целей выделения, но также и для
изучения специфических взаимодействий, происходящих в биохимическиих
процессах.
Список используемых обозначений
Л -константа в теории Дебая - Хюккеля а - ионный радиус (А) ае, Ol, Gel -
активность фермента, лиганда и фермент-лигандного комплекса
соответственно В -константа в теории Дебая - Хюккеля се, Cl, Cel -
концентрация фермента лиганла и фермент-лигандного комплекса (моль/л)
Cl0-общая эффективная концентрация лиганда (моль/л) D -диэлектрическая
проницаемость раствора Е - фермент EL - фермепт-лигаидпый комплекс /* -
ионная сила раствора
Ki - константа гидрофобности для /-го компонента (например, К с. Kl, К
el, Кх)
К - константа связывания при /s = 0; см. уравнение (5.14) Кс -константа
связывания; см. уравнение (5.6)
Ко - определяется разностью Kel-Kl-Ке\ см, уравнение (5.13)
L -лиганд t - время (мин)
Zf-заряд /-го компонента (например, ZE, ZL, Zel, Zx)
- коэффициент активности /-го компонента (например, Yf, Yl, Yel, Yx)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Akanuma И., Kasuga A., Akanuma Т., Yamasaki М., Biochem. Biophys. Res.
Comm., 45, 27-33 (1971).
2, Comer M. JCraven D. B., Harvey M. J., Atkinson A.. Dean P. D. G., Eur.
J., Biochem., 55, 201-209 (1975).
3 Craven G. R., Steers Jr., E., Anfinsen С. B., J. Biol. Chem., 240,
2468-2477 ' (1965).
4. Cuatrecasas P., J. Biol. Chem., 245, 3059 3065 (1970).
5 Cuatrecasas P.. Wilchek М., Anfinsen С. B., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.,
61, 636-643 (1968).
6 Dean P. D. G.. Craven D. B., Harvey M. JLowe C. R., Advan. Exp. Med.
Biol., 42, 99-121 (1974).
7. Graves D. J.. Wu Y.-T., Methods Enzymol., 34, 140-163 (1974).
8. Harvey M. J., Lowe C. R., Craven D. B" Dean P. D. G., Eur. J.
Biochem., 41. 335 340 (1974).
9 Harvey M. J., Lowe C. R., Dean P. D. G., Eur. J, Biochem., 41, 353-357
(1974).
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
103
10. Hipwell М. С.. Harvey М. 1., Dean P. D. О., FEBS Lett., 42, 355-359
(1974).
11. Hixson Jr. Н, F., Mischikawa A. H., Arch. Biochem. Biophys., 154,
501-509
(1973).
12. Hofstee В. H. J., Bioclicm. Biophys. Res. Comm., 50 , 751-757 (1973).
13. Holguin J., Cardinaud R.f Eur. J. Biochem.. 54, 505-514 (1975).
Предыдущая << 1 .. 33 34 35 36 37 38 < 39 > 40 41 42 43 44 45 .. 198 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed