Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Туркова Я. -> "Аффинная хроматография" -> 41

Аффинная хроматография - Туркова Я.

Туркова Я. Аффинная хроматография — М.: Мир, 1980. — 472 c.
Скачать (прямая ссылка): afinnayahromatografiya 1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 198 >> Следующая

нуклеотида с миокиназой или глицеральдегид-3-фосфатдегидро-геназой уже
аденозиновая часть лиганда играет эту роль.
Серьезным ограничением для применения в аффинной хроматографии общих
лигандов является их низкая избирательность.
106
Глаиа 6
Поэтому для разделения сложной смсси ферментов, которые могут
сорбироваться, необходимы дополнительные средства.
Если иммобилизованный аффинный лиганд обнаруживает сродство более чем к
одной комплементарной молекуле, это отражается на специфической форме
изотермы адсорбции. На рис. 6.1 даны примеры изотерм адсорбции для
четырех ферментов, каждый из которых обнаруживает индивидуальное сродство
к иммобилизованному аффинному лиганду [35]. Фермент 1 обладает очень
высоким сродством к специфическому сорбенту с константой диссоциации
10~7-10-8 моль/л. Ферменты 2 и 3 обладают меньшим сродством к сорбенту с
константами диссоциации ~10_Е> моль/л, а аффинность фермента 4
оценивается константой диссоциации >10_3 моль/л.
Можно записать уравнение изотермы адсорбции Лэнгмюра в обобщенной форме:
4l '
где qi - доля адсорбированного вещества г, С,- концентрация сорбируемого
вещества г, a k\ и k2- константы. При низких концентрациях Ci уравнение
(6,1) сводится к qi^k\k2Cs, а при высоких Ci - к qi = k2. В общем виде
?1=/(С,У, (6.2)
где Отсюда, если концентрация лиганда достаточно
высока, так что емкость сорбента не является лимитирующим фактором, доля
qi адсорбированного вещества i зависит от его концентрации в подвижной
фазе С,-, а не от его сродства к прикрепленному аффинному лиганду. Для
образна, содержащего эк-вимолярные количества четырех ферментов, доля
каждого адсорбированного фермента - qi, q2, q% и q^. При вытесняющей
хроматографии с помощью сорбирующегося конкурирующего элюента с
концентрацией D при элюировании ферментов /, 2 и 3 их концентрации в
элюате равны Сь С2 и С3. Фермент 4 появится в элю-ате перед выходом
вытесняющего конкурирующего сорбирующегося элюента, потому что его
изотерма адсорбции не пересекает прямую концентрации этого элюента (рис.
6.1). Фермент с высоким сродством не вытесняет менее сильно связываемый
фермент, даже если после начальной сорбции продолжать добавлять фермент с
высоким сродством. Только когда емкость сорбента превзойдена, то в элюате
в объеме колонки появятся ферменты как с низкой, так и с высокой
аффинностью, а не только ферменты с низким сродством. Это особенно важно
помнить при разделении ферментов, обнаруживающих сродство к общим
лигандам.
Выбор аффинных лигандов
107
Иногда перед адсорбцией на специфическом сорбенте бывает необходимо
освободиться от белков-примесей путем предварительного фракционирования.
Если изменить условия адсорбции, такие, как pH, ионную силу, температуру,
скорость потока и диэлектрическую проницаемость, можно избирательно
исключить некоторые ферменты. Более того, для предотвращения адсорбции
некоторых из них можно добавить в раствор ингибитор или другие лиганды.
Используя носитель с порами малого размера, можно исключить белки с
высокой молекулярной массой. Повысить избирательность можно также,
применяя специфическое элюирование. Специфические ингибиторы или
субстраты могут быть применены для избирательного элюирования
индивидуальных ферментов. В гл. 10 приведены примеры разделения смесей
ферментов на сорбентах с групповой специфичностью; для выделения
индивидуальных веществ применялись градиенты pH, ионной силы или
температуры.
На избирательность аффинных лигандов может влиять также природа
нерастворимого носителя [20]. Протеолитические ферменты, пришитые к
отрицательно заряженному сополимеру ма-леиновой кислоты и этилена,
сорбируют только те ингибиторы, пзоэлектрическая точка которых <4-5. Если
сильный отрицательный заряд цепи сополимера нейтрализовать, присоединив,
например, гексаметилендиамин и диметилендиамин, образующееся
полиамфотерное производное становится пригодным для выделения ингибиторов
даже с более низкими изоэлектрическими точками.
Как это детально показано в разд. 6.3, антитела проявляют высокое
сродство к соответствующим антигенам и наоборот. Трудности их
освобождения из комплексов обусловлены именно этим сильным
взаимодействием. Использования сильных хаотропных элюентов в
иммуноаффинной хроматографии можно избежать путем химической модификации
иммобилизованных аффинных лигандов [39]. Например, элюирование
антиглюкагоновых антител из колонки с иммобилизованным глюкагоном может
быть осуществлено в мягких условиях, если частично нарушить
пространственную комплементарность к связывающему участку антитела путем
избирательной модификации гормона, например реакцией с 2-окси-5-
нитробензилбромидом, тетранитрометаном или перекисью водорода.
О'Карра [43] рекомендует различать аффинные системы с небольшими
лигандами и с макролигандами. Низкомолекулярные синтетические лиганды
предпочтительнее главным образом благодаря их стабильности и лучшей
доступности. Специфические сорбенты, приготовленные из них, обычно лучше
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 198 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed