Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
фермент. Это позволяет ввести в хроматографию предварительный отбор -
избирательное связывание, последующее элюирование достигается удалением
лиганда А из рабочего буферного раствора.
Для большинства пиридиннуклеотидзависимых дегидрогеназ имеет место
упорядоченный кинетический механизм согласно схеме:
где Е - дегидрогеназа, NAD+ и NADH - окисленная и восстановленная формы
ннкотиначидадениндинуклеотида, Р - продукт, а S - субстрат. На рис. 6.3
приведены результаты аффинной хроматографии глкжозофосфатдегидрогеназы из
эритроцитов человека [68]. Фермент, связанный с NADPH, эффективно
сорбировался на агарозе, к которой был привязан NADP через дигидра-зид
адипиновой кислоты. Фермент специфически элюировался с колонки при помощи
NADP .в элюирующем буферном растворе. Упомянутый кофермент является одним
из наиболее распространенных в аффинной хроматографии. Другими часто
используемыми аффинными лигандами являются нуклеотиды аденина, ури-
NADH Р
4 4
S NAD+
¦ +
Е
eNAOH e?ADH ?NAD* ?. NAD*
Выбор аффинных лигандов
Ш
дина, гуанина и флавина, коферменты пиридиксаля, фолата н их аналоги,
биотин, липоевая кислота, кобаламипы и производные порфирина. Примеры их
использования приведены в табл. 11.1; для детального ознакомления можно
рекомендовать книгу Лоу и Дина [35],
В качестве примера на рис. 6.4 приведены данные по аффинной хроматографии
алькогольдегидрогеназы и фосфофруктокиназы из
Рис. 6.3. Хроматография глюкозо-О фосфатдегидрогеназы, связавшей NADPH.
на колонке с NADP-агарозой [68].
10 мл частично очищенного образна фермента с NADPH (41 ед.) Наносился на
колонку (лОХ5 мм. объем колонки 1 мл) с NADP-агароэой, уравновешенную
0,01 М. трнс-НСЬбуфером <Г 11 8,0), содержащим 10 ммоль/л MgClj. Поело
нанесения раствора фермента {одиночная стрелка) колонка промывалась
непрерывно буфером. Затем (двойная стрелка) колонка элюировалась буфером,
содержащим 1 ммоль/л NADP. Скорость потока 4 мл/мин; ?5 °С
частично очищенного экстракта Bacillus stearothermophilus на N6-(6-
аминогексил)-57-АМР-сефарозе [7], Ферменты элюируются ударным введением 5
мМ NADH (для алкогольдегидрогеназы) или 5 мМ ATP - Mg2+ (для
фруктокиназы) (рис. 6.4, а), а также градиентом концентрации КС1 (рис.
6.4,6) и градиентом pH (рис. 6.4, в).
Пр имером аллостерического эффектора для получения специфического
сорбента является п-аминофениловый эфир dATP, связанный с сефарозой; он
использован для выделения Т4 рибо-нуклеотидредуктазы [5]. Для выделения
ADP - глюкозопиро-фосфорилазы из Escherichia coli Хауген и др. [25]
использовали аффинную хроматографию на сефарозе с присоединенным Р'-(6-
112
Глава 6
Рис. 6.4. Специфическое элюирование алкогольдегидрогеназы и
фосфофруктокн-назы с Ыв-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозы [7].
A, Проводились исчерпывающий диализ 0,5 мл экстракта фермента,
содержащего 40.5 Е фосфофруктокинаэы и 10 Е или 9,9 мг/мл
алкогольдегидрогеназы, против 10 мМ фосфата <рН 6.8). содержащего 0,2
моль/л К.С1 (этот буфер был тахже использован для уравновешивания), и
адсорбция на колонке с АМР - сефарозой. Затем матрица последовательно
промы валась: а) уравновешивающим буфером (24 мл); б) 5 мМ. NADH в том же
буфере 15 мл); в) буфером (5 мл); г) 5 мМ АТР+5 мМ Mg*+ в буфере (5 мл).
Скорость потока 0,4 млАкни. Б, Элюирование в градиенте концентрации КС! в
условиях, описанных выше <А). После адсорбции колонка промывалась 20 мл
10 м.М фосфатом (pH 6,8), содержащим 0,2 молъ/л КС1. Линейный градиент
концентрации (0,2-0,8 моль/л) КС1 создавали в том же буфере; объем
элюата 40 мл.
B. Элюирование в градиенте pH в условиях, описанных выше (А); однако
образец уравновешивался 10 мМ N-2 окенэтнлпнперэзнн-Ы'-г-этэнсульфонатом
(pH 6,8). После адсорбции
Колонка промывалась тем же буфером <20 мл). Затем задавали градиент pH
(объем элюента 40 мл): 10 мМ окскэтилпиперазкнЭтансульфат+5 мМ
глицилглиинн, pH 10,4. t - белок; 2 - глицералъдегнд-
Зфосфатдегидрогеказау 3 - алкогольдегидрогеназа; 4 - фос-
фофруктокнназа.
фосфо-1-гексил)-Р2-{6-амино-1-гексил) пирофосфатом, который имеет
сходство с аллостерическим активатором. Примером выделения фермента с
использованием укрепленного на носителе антитела является аффинная
хроматография щелочной фоефатазы на сефарозе с ковалентно связанными
антителами к этому белку [47].
______________________Выбор аффинных лигандов_____________________113
Выделение ферментов на сорбенте со свободными SH-rpynna-ми рассмотрено в
разд. 6.6.
Для выделения ингибиторов и кофакторов наиболее часто в качестве аффинных
лигандов используются связанные ферменты. На рис. 6.5 сопоставлены данные
по выделению ингибитора химотрипсина из неочищенного экстракта картофеля
на сфероне с ук-
Рис. 6.5. Хроматография неочищенного экстракта картофеля на: а - сфероне
300;
б - химотрнпсин-сфероне 300 [56],
3 г неочищенного экстракта картофеля наносились на колонку (20X18 мм);
собирались фракции по 10 мл с интервалом в f ч. J ~ оптическая плотность
