Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
95
Работы О'Карра и др. [26] показали, однако, что наиболее часто причиной
"мнимой аффинности" систем является неспецифическая' сорбция на
незаряженной пространственной группе или даже не-биоспецифическая сорбция
белков, обусловленная гидрофобными взаимодействиями. При близком
рассмотрении становится очевидным, что эти гидрофобные взаимодействия
могут быть полезны для разделения многих веществ; для этого типа
хроматографии
Рис. 5.18. Хроматография р-галактозидазы из Escherichia colt на сефарозе
4В, модифицированной 3,3'-диамйкодипропиламином [23].
Образец (5 мл) с 0,5 мг фермента наносился на колонку (109X16 мм) при pH
7,5 .в 0,05 М трис-HCl буфере, содержащем 0,10 моль/л NaCl н 0,01 моль'л
MgCli. Скорость потока 20 мл/я; отбор фракций осуществлялся через 3,5
мин.
введен термин "гидрофобная хроматография". Она более детально рассмотрена
в разд. 7.1.
Морроу и др. [23] разработали полуколичественную теорию неспецифического
связывания белков на замещенных хроматографических аффинных носителях,
которое обусловлено электростатическими и гидрофобными взаимодействиями.
В разд. 5.1 детально рассмотрено выделение р-галактозидазы из Escherichia
coli, проводимое на сефарозе с прикрепленным ингибитором (п-аминофе-нил-
р-о-тиогалактопиранозидом) [31]. Активный сорбент получали присоединением
ингибитора через пространственную группу, полученную из бис-(3-
аминопропил) амина и янтарного ангидрида. Однако активность сорбента была
значительно ниже, если эта пространственная группа обладала гидрофильными
свойствами [26]. Робинсон и др. [29] использовали аффинный сорбент, при-
96
Глава 5
мененный вначале Стирсом и др. [31], для изучения влияния ионной силы
раствора на очистку р-галактозидазы. Фермент связывался с сорбентом
обратимо при ионной силе - 0,05. При более низкой ионной силе (0,01)
происходит необратимое связывание фермента.
Учитывая эти данные, Морроу и др. [23] исследовали влияние ионной силы
раствора на константу равновесия адсорбции и на константу скорости
десорбции р-галактозидазы на сефарозе с присоединенным к ней бис-(3-
аминопропил) амином. На рис, 5.18 приведены данные хроматографии р-
галактозидазы на этом сорбенте в 0,05 М трис-НС1-буфере, содержащем 0,1 М
хлорид натрия и 0,01 М хлорид магния (pH 7,5). Около 90% фермента,
пропущенного через колонку, не задерживаются и только 10% остаются
связанными в колонке посредством электростатических связей и могут быть
элюированы растворами с высокой ионной силой, например 1 М хлористым
натрием. На основании этих результатов можно сделать вывод, что в данных
условиях аминная часть лиганда мало участвует в связывании фермента. При
хроматографии р-галактозидазы в аналогичных условиях (единственное
отличие состояло в том, что к 0,05 М трис-НС1-буферу не добавлялись соли)
почти весь нанесенный фермент был неспецифически связан в колонке; 85%
фермента десорбировалось при увеличении ионной силы буферного раствора
добавлением 1 М хлористого натрия. Очень хорошие результаты получались,
если связывание р-галактозидазы на замещенном геле проводилось при
высокой ионной силе (1,8 М фосфатный буферный раствор), а последующее
элюирование при помощи растворов с понижающимся линейным градиентом
ионной силы.
5.8,2. Применение теории Де^бая - Хюккеля при изучении зависимости
константы равновесия адсорбции и скорости десорбции фермента с замещенных
гелей от ионной силы"1
Равновесие взаимодействия фермента Е с лигандом L, связанным на
поверхности геля, приводящее к образованию фермент-лигапдного комплекса,
описывается уравнением (3.1)
Е + L *=* EL
Дальнейший анализ основан на модели, близкой теории Дебая - Хюккеля для
растворимости белков или для взаимодействия ингибиторах активным центром
[23]. Предварительным условием дальнейших рассуждений является
требование, что фермент не должен обнаруживать никакого притяжения к
поверхности геля. Это, например, не соблюдается для системы лизоцим -
сефароза.
* Список обозначений ем. на стр. 102.
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
97
Константу равновесия для диссоциации К согласно написанной выше реакции
можно выразить через активности фермента аЕ, лиганда аЕ и фермент-
лигандного комплекса аЕЕ:
К= °^_=.?Мк. VeVl, (5>5v
"EL CEL YEL '
где ye, Yl и yel - коэффициенты активности, a cE, cL и cEl - концентрации
каждого компонента системы. В отличие от активности концентрацию с можно
легко измерить, поэтому Морроу и др. [23] ввели концентрационную
константу равновесия Кс'.
(5.6)
Уравнение (5.5) может быть переписано следующим образом:
(5.7)
К YeYl 7
Взаимодействия фермента с лигандом осуществляются благодаря и
электростатическим, и гидрофобным силам. Коэффициент активности yj t-ro
компонента, проявляющего и электростатические, и гидрофобные свойства,
согласно расширенной теории Дебая - Хюккеля, описывается уравнением
1 = -AZtVU + К1 (58)
& ' 1 + в Vis
где 1$ - ионная сила раствора, Zt - заряд (-го иона, Ki - константа,
