Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
уравновешивания на эффективность колонки с Ы6-(6-ами-ногексил)-5'-АМР-
сефарозой [21]. Если глицерокиназа и лак-татдегидрогеназа уравновешены с
сорбентом, то обе величины,
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
83
Таблица 5.3
Влияние времени уравновешивания на эффективность колонки с №-
(6'аминогексил)-5'-АМР-сефарозой*
Время уравнове- шивания, ч Глицерокнназа
Лактатдегндрогеназа из Мышцы сердца свиньи
количество связанной, % Р (концентрация КС1, ммоль/л)(r)
ширина пика, мл ВЭТТ,(r) мм количество связанной, % р
(концентрация КС1. ммоль/л)(r) ширина пика, мл ВЭТТ,(r) мм
1 26 20 7,0 0,42 100 360 18,5 1,50
20 51 50 6,0 0,25 too 355 11,2 0,52
67 59 150 5,6 0,17 100 490 13,8 0,76
а Образец (100 мил), содержащий фермент (5Е) и бычий сывороточный
альбумин <1.5 мг). наносился и промывался на колонке <34X5 мы) с Ы1-(6-
аынногексил)-5'-АМР - се-фарозой (0.55 г влажного сорбента, содержащего
0.125 мкмоль/мл 5'-АМР),
0 ВЭТТ определяется как отношение высоты колонки к величине 16 (Vel!")а,
где Ve- объем элюирования от начала градиента концентрации KCI до центра
пика фермента, w - ширина пика фермента у основания.
оценивающие эффективность колонки, - высота, эквивалентная теоретической
тарелке (ВЭТТ), и связываемость фермента |} - возрастают со временем
уравновешивания вплоть до 67 ч. Вообще снижение ВЭТТ равносильно
повышению эффективности сорбента [19]. В случае глицерокиназы процент
связанного фермента также возрастает.
Из сопоставления ВЭТТ можно сделать важные практические выводы, а именно
найти аффинный сорбент, характеризующийся не только хорошей
связываемостью, но и лучшей избирательностью. Очевидно, таким образом
Олсон и др. [28] обнаружили, что необходимо прекратить поток раствора в
колонке за несколько часов перед специфическим элюированием. Время
уравновешивания не влияет на связываемость лактатдегидрогеиазы на
иммобилизованном NAD+ или на связываемость глицерокиназы на
иммобилизованном АТР, если перед элюированием ферменты в течение 1,5 и 20
ч соответственно оставлять в контакте с иммобилизованными нуклеотидами
[19]. Этот факт можно использовать для хранения ферментов, устойчивость
которых зависит от присутствия субстратов или кофакторов.
Сам факт иммобилизации лиганда, а также ограничения, обусловленные
наличием постоянной пленки на поверхности и внутри пор носителя, приводят
к тому, что на кинетику реакции в целом влияют процессы диффузии.
Диффузионное лимитирование, налагаемое природой н механизмом
хроматографических процессов, можно разделить на три типа [19]:
6*
84
Глава 5
1. Продольная диффузия, которая представляет собой классическую
молекулярную диффузию Фика, создается концентрационным градиентом и может
действовать как радиально, так и вдоль оси. В обычных условиях аффинной
хроматографии она не имеет большого значения, но может стать важной при
медленных скоростях потока в слабо взаимодействующих системах.
2. Диффузия Эдди может стать очень важным фактором при высоких скоростях
потока. Она возникает в результате неравномерностей потока, вызываемых
частицами геля в колонке. Если скорость достижения равновесия очень мала,
то растворенные молекулы, движущиеся в быстрой струе, менее успешно
взаимодействуют с иммобилизованным аффинантом, чем те, которые находятся
в медленном потоке,
3) Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах
матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к
прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии
можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень
пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для
достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по
возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения
стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества
нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно
если общая концентрация белков в образце была высока (20-30 мг/мл) [5].
Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью
сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец.
Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на Г46-(6-аминогексил) -5'-АМР
- сефарозе от скорости потока исследована Лоу и др. [21]. Было найдено,
что увеличение скорости потока относительно мало влияет па сорбцию. При
высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ) , а также
связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в
небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью
элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка
(бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч)
также не обнаружено.
В одноразовом методе сорбции на аффинном сорбенте играет важную роль
концентрация фермента в исходном растворе. В табл. 3.1 приведен процент
насыщения иммобилизованного аффинанта сорбируемым ферментом при различных
