Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
Кальдероном и др. [16]. При выделении ацетилхолинэстеразы аффинный
сорбент теряет свою специфичность, если концентрация лиганда возрастает
от 0,15-10-3 до 1,6-10-3 моль/л. Критические концентрации лиганда
составляют, следовательно, ~ Ю~3 моль/л, что соответствует расстоянию
между ближайшими соседними молекулами лиганда, равному - 100 А, если
предполагается равномерное распределение молекул лиганда внутри геля в
узлах кубической решетки. Понятно, что при концентрации <10"3 моль/л
молекулы лиганда находятся на достаточно больших расстояниях друг от
друга, чтобы предотвра-
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
81
тить одновременное взаимодействие неспецифнческих белков более чем с
одной заряженной группой, На таком свободно распре-, деленном лиганде с
заряженными группами могут поэтому сорбироваться только молекулы с
"холинузнающим" центром, но не с другими неспецифическими отрицательно
заряженными группами.
Другим нежелательным явлением в некоторых сорбентах с
Номер фракции
Рис. 5.9. Хроматография неочищенного экстракта мембраны из электрического
органа Torpedo californica на сефарозе 2В, содержащей 2-10-3 (а) и 0,4-
•10-3 моль/л (б) NH(CH2)5CONH(CH2)3N+(CH3)3 [30].
Пастеровские пипетки наполнялись аффинными сорбентами (объем геля ~L,S-2
мл)г которые уравновешивались буферным раствором [Ю мМ, фосфат натрия (pH
7,4)+0,1% эмульфогена]. Небольшие количества неочищенного экстракта (0,6-
3,0 ыг" что соответствует 2-6 ед.) наносились на колонку и промывались
тем же буфером. Стрелка указывает начало элюирования линейным градиентом
концентрации (0-1 моль/л) NaCI (общий объем элюата 100 мл). Объем фракции
'-!г6 ил; определялись содержание белка (Д"я) и токсинсвязывающая
активность (имп/мин).
высокой концентрацией аффинного лиганда является слишком сильное
взаимодействие с выделяемым веществом, что затрудняет его элюирование.
Так, например, тщательный контроль концентрации лиганда имеет решающее
значение для выделения глюкокиназы на агарозе со связанной N-(6-
амипогексил)-2-амино-2-дез-окси-ю-глюкопиранозой [14] (рис. 5.6).
5.4. КОНЦЕНТРАЦИЯ БЕЛКОВ, ВРЕМЯ УРАВНОВЕШИВАНИЯ И СКОРОСТЬ ПОТОКА
Концентрация подлежащего выделению вещества в растворе влияет по-разному
в зависимости от того, происходит ли аффинное разделение в колонке или в
статических условиях (одноразовый метод). Другим важным фактором является
степень аффинности взаимодействий комплементарных участков выделяемого
вещества
6-6
82
Глава 5
и аффинанта. Время уравновешивания и скорость потока в колонке связаны с
этим фактором.
В колоночной аффинной хроматографии достаточно сильное взаимодействие
выделяемых веществ с иммобилизованным аффинным лигандом приводит к
концентрированию вещества и его медленной миграции вниз по колонке. Этот
процесс зависит от концентрации лиганда и почти не зависит от начальной
концентрации свободных макромолекул. Например, в аффинной хроматографии
глицерокиназы или лактатдегидрогеназы на №-(6-ами-ногексил)-5'-ЛМР-
сефарозе не наблюдалось влияния концентрации фермента на емкость, если
концентрации ферментов прямо пропорциональны концентрациям нуклеотида или
зависимость между ними близка к таковой [21]. Необходимые при этом
требования заключаются в том, что комплементарные макромолекулы следует
наносить на колонку в ненасыщающих количествах, а также подбирать
скорость потока раствора [19].
Возможны две причины появления выделяемого белка в свободном объеме
элюата при высоких скоростях потока в перегруженных колонках. Первая
обусловлена процессом, известном как вторичное исключение. Скорость
диффузии молекул в гель зависит не только от размера пор, но также и от
соотношения между размером молекул и объемом пор. При нанесении на гель
концентрированного раствора высокомолекулярного вещества с крупными
молекулами одни из этих молекул будут сразу диффундировать в доступные
поры, одпако для молекул, пришедших позже, многие поры уже окажутся
занятыми, поэтому вероятность диффузии в занятые поры понижается из-за
уменьшения объема доступных пор. Это приводит к исключению вещества из
пор, содержащих иммобилизованный лиганд, ставший недоступным из-за
уменьшения объема пор. Вторая причина обусловлена стериче-скими
затруднениями для последующих молекул, создаваемых уже адсорбированными
молекулами белка. Глобулярный белок среднего размера, такой, как
гемоглобин, покрывает площадь около 2500 А2 [19], что само по себе
создает пространственные затруднения.
Поскольку взаимодействие макромолекул с иммобилизованным аффинантом -
процесс, зависящий от времени, па него влияет скорость потока в колонке и
время установления равновесия. Во многих случаях адсорбционное равновесие
достигается очень медленно. Для взаимодействия макромолекул с
иммобилизованным аффинантом недостаточно простых столкновений молекул, а
необходимы также точная ориентация связывающих участков или их
конформационная подстройка. В табл. 5.3 показано влияние времени
