Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
в связывающем центре фермента, подвержены также значительному влиянию
ионной силы. Поэтому и pH, и ионная сила - важные факторы при сорбции и
десорбции, О влиянии pH и ионной силы на сорбцию химотрипсина на
иммобилизованном бензилоксикар-бонилглицил-ц-фенилаланипе уже упоминалось
в гл. 3 (рис. 3.1), Касаи и Ишии [17] обнаружили увеличение константы
диссоциации комплекса трипсина с иммобилизованным глицилглицил-ь-
аргинином от 0,23 до 0,33 мМ при добавлении 0,3 М хлористого натрия и до
0,75 мМ при добавлении 1,0 М хлористого натрия. Влияние взаимозависимости
констант равновесий в ходе сорбции и десорбции при аффинной хроматографии
уже было рассмотрено детально в гл. 3 и четко показано Грейвсом и By [7]
(рис. 3.5).
Влияние pH на связывание лактатдегидрогеиазы на аффинных сорбентах,
таких, как №-(6-аминогексил)-5'-АМР- сефароза или 6-аминогексаноил-КАО+ -
сефароза, показано на рис. 5.15 [22]. До pH 8 взаимодействие фермента с
иммобилизованным лигандом не зависит от pH. В зависимости от природы
иммобилизованного аффинанта при рН>8 количество связанного фермента
уменьшается. Для N6-(6-аминогексил)-5'-АМР- сефарозы это уменьшение
характеризуется кажущейся величиной рК~9,7, а для 6-амино-гексаноил-ЫАО+
- сефарозы рАС8,5. Различие полученных рК может быть обусловлено
неодинаковыми условиями приготовления аффинных сорбентов. В то время как
первый из них готовится путем присоединения к сефарозе нуклеотида, уже
снабженного пространственной группой N6-(6-аминогексил)-5'-АМР, во втором
случае NAD+ присоединяется к 6-аминогексаноилу, уже закрепленному на
сефарозе; в последнем случае возможно сохранение на носителе
непрореагировавших заряженных групп. Винер и Шверт [32] показали, что
связывание NAD+ лактатдегидрогеназой в свободном растворе управляется
группой на поверхности фермента с р/Г-9,7; это значение хорошо
согласуется с тем, которое определено для N6-(6-аминогексил)-5'-АМР-
сефарозы.
Для проверки этого предположения Лоу и др. [22] сопоставили кривые
титрования 6-аминогексаноил-№АВ+-сефарозы, немоди-фицированной сефарозы и
6-аминогексаноил - сефарозы, а также соответствующих производных
целлюлозы; они продемонстрировали различное влияние носителя (см. рис.
8.1).
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
91
Если аффинный сорбент приготовлен из заряженного аффинанта, то при
увеличении ионной силы раствора аффинность сорбента по комплементарной
ему макромолекуле уменьшается. Сорбцию следует проводить из растворов с
низкой ионной силой; однако этот процесс может вызвать нежелательные
следствия; ко-
рН
Рис. 5.15. Влияние pH на связывание лактатдегидрогеназы мышцы сердца
свиньи е-аминогексаноил-ЫАО+-сефарозой {а) и М6-(6-аминогексил)-АМР -
сефарозой
(б) [22],
Результаты выражены через относительную свя.шваемость при pH 6,5. а -
при pH
и,5 и элюировании в линейном градиенте концентрации КО (0-1 моль'л); б -
процент фер* мснтативноЗ активности, элюируемой ударным введением NADH
(200 мкл, 5 мМ). Использовались доведенные до постоянной
электропроводности (3.3 мОм-1) при помощи 1 М КС1 буферные растворы: / -
)0 мМ. (KH3PO4 + KOII), 2-10 мМ (трнцни + КОН), 3 - 10 мМ (гли-цнн+КОН) и
4 - 10 мМ КаНРО<, Образец, содержащий фермент (100 мкг) и бычий сыворо
точный альбумин (1,5 мг). наносился на колонку с 0,5 г Кй>(6-
аыниогекснл)-5/-АМР-сефар*/-эой (1.5 мкмоль/мл АМР), предварительно
уравновешенную соответствующим буфером н<> методике, указанной в подписи
к рис. 4.6.
личество примесных белков увеличивается; их сорбция, обусловленная
взаимодействиями ионного характера с лигандом, также возрастает. Примером
является аффинная хроматография ацетил-холинэстеразы [16], рассмотренная
в разд. 5.3.
Применение для элюирования специфически сорбированных веществ градиента
pH и градиента концентрации соли и влияние ионной силы и неспецифической
сорбции рассмотрены далее в гл. 10.
92
Глава 5
5.7. ЭЛЮИРОВАНИЕ КОНКУРЕНТНЫМИ АФФИННЫМИ ЛИГАНДАМИ
Теоретические основы элюирования ферментов конкурентными ингибиторами уже
рассмотрены в гл. 3 (рис. 3.6).
Схема образования комплексов в системе, содержащей выделяемый фермент
(Е), специфически сорбируемый на иммобилизованном лиганде (L), и
растворимый ингибитор (I), показана па рис. 5.16 [1]. Влияние ингибитора
в подвижной фазе на движение фермента в колонке может быть трех типов:
1. Конкурентное действие. Если тройной комплекс ELI менее устойчив,
чем двойной EI, при повышении концентрации ингибитора I увеличивается
доля фермента в подвижной фазе, тем самым ферменты в колонке удерживаются
слабее.
Рис. 5.16. Возможные компоненты системы, включающей фермент, ингибитор
и матричный лиганд [1]-
L - ковалентно привязанный к матрице аффинный лиганд, / - нефиксированный
ингибитор, Е - фермент
2. Неконкурентное действие. Если устойчивость тройного комплекса ELI
близка к устойчивости двойного EI, связывание ингибитора I не влияет на
сродство фермента к иммобилизованному лиганду и присутствие ингибитора не
