Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
концентрациях фермента в исходном растворе [7]. Очевидна прямая
пропорциональность. Такая же зависимость обнаруживается и на рис. 5.3,
где приведены теоретические и экспериментальные данные для содержания
комплекса фермент - иммобилизованный лиганд на аффинных сорбентах с
различной концентрацией лиганда. Для
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
85
успешной сорбции необходимы высокие концентрации ферментов, особенно с
сорбентами с низким содержанием присоединенного аффинного лиганда.
Данные, приведенные на рис. 5.10, а, показывают влияние концентраций
лактатдегидрогеназы и глицерокиназы на емкость М6-(6-аминогексил-5'-АМР)-
сефарозы в статических условиях [21]. Процент связанного фермента
возрастает с ростом его концентрации, причем наиболее предпочтительны для
работы концентрации ^2 ед./мл. Хотя связываемости лактатдегидрогеназы
Рис. 5.10. Влияние концентрации фермента (а) и времени инкубации (б) на
емкость Ne-(6-aMHHoreKcii.i)-5'-АМР-сефарозы по лактатдегидрогеназе (/) и
глицерокиназе (2) в условиях одноразового метода [21].
Фермент, разбавленный уравновешивающим буфером НО мМ (КНгРО*+К.ОН). pH
7,5] до подходящей концентрации (л), или 10 Е лактатдегидрогеназы.
суспендированной в 100 мл уравновешивающего буфера (б), инкубировались с
ам1шогексил)-5'-АМР-сефарозой
(0,5 г влажного препарата сорбента, 1.5 мкмоль/мл 5' АМР) ъ смесителе
Коултера при 4.5 °С. Через 30 мнн (о) или определенные интервалы времени
(,6) инкубация приостанавливалась к после отстаивания сорбента (через 15
мин) удалялся супернатантный раствор. При пятиминутных периодах инкубации
сорбент отмывался тремя порциями по 5 мл уравновешивающего буфера, затем
вновь суспендировался с 2,5 мл уравновешивающего буфера и переносился в
колонку (50X5 мм). Для элюирования через колонку пропускалось 11,0 мл
уравновешивающего буфера, содержащего линейный градиент концентрации (0-
1,0 моль/л) KCI (общий объем элгоата 20 мл). Ферменты определялись в
промывках и элюатах колонки.
и глицерокиназы значительно различаются (относятся как 40:1), отношения
процента связанного фермента к его концентрации фактически совпадают.
Влияние времени инкубации (уравновешивания) на емкость Ы6-(6-
аминогексил)-5/-АМР - сефарозы при связывании лактатдегидрогеназы в
статических условиях [21] показано на рис. 5.10,6. Связываемость фермента
иммобилизованным нуклеотидом наиболее круто растет вначале, затем кривая
становится более пологой; 100% фермента связывается через 16 ч, а 50%-ное
связывание достигается за 20 мин. Данные сорбции химотрипсина на ЫН2-сфе-
роне с присоединенными карбобензокси-о-фенилаланином приведены на рис.
3,1; они указывают, что равновесие достигается быстрее. На рис. 10.4
показано, как на достижение равновесия влияет разбавление.
86
Глава 5
5.5. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ
Адсорбция растворенного вещества из подвижной фазы стационарной фазой,-
как правило, экзотермический процесс; согласно принципу Ле Шателье,
повышение температуры должно приводить к сдвигу равновесия в направлении
поглощения тепла. В условиях хроматографии повышение температуры сдвигает
равновесие к более высоким относительным концентрациям в подвижной фазе,
и высокие температуры приводят к более быстрой миграции через
хроматографическую колонку. Вообще для ферментов с более экзотермической
адсорбцией наблюдается большая зависимость последней от температуры [9].
Зависимость константы распределения К от абсолютной температуры Т дается
уравнением
Я = ,e-AHVRT = const .e-AHVRTf (5,3)
где AS0- стандартная энтропия, АН0- стандартная энтальпия адсорбции, a R
- газовая постоянная. Для ферментов с различными энтальпиями адсорбции (-
ДН°) зависимость адсорбции от температуры может быть использована для
разделения.
На примере сорбции алкогольдегидрогеназы и глицерокиназы изучено влияние
температуры на емкость №-(6-аминогексил)-5'-АМР - сефарозы при двух
концентрациях иммобилизованного нуклеотида [9]; результаты приведены на
рис. 5.11. При низком содержании аффинанта (1,5 мкмоль/мл АМР) повышение
температуры существенно влияет на количество фермента, связанного с
аффинным сорбентом. Однако если концентрация связанного нуклеотида в
сорбенте высока {4 мкмоль/мл АМР), то температура практически не
сказывается на сорбции. Однако изменения концентраций иммобилизованного
АМР никак не влияют на температурную зависимость связываемости р
алкогольдегидрогеназы и глицерокиназы на №-(6-аминогексил)-5'-АМР -
сефарозе: во всех изученных примерах при повышении температуры
связываемость р уменьшалась [9]. График Аррениуса для связываемости р
глицерокиназы на иммобилизованном АМР линеен в интервале 0,5-35 °С. Для
сефарозы, содержащей 4,0 мкмоль/мл АМР, энергия адсорбции фермента
составляет 20,2 кДж/моль (4,8 ккал/моль), а для сефарозы, содержащей 1,5
мкмоль/мл АМР,-24,6 кДж/моль (5,9 ккал/моль).
Для аналогичного связывания алкогольдегидрогеназы наблюдается двухфазный
график Аррениуса с энергиями адсорбции 24,6 кДж/моль (5,9 ккал/моль) и
