Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
мутации; таким образом, чтобы найти необходимый белок, требуется скрининг
множества мутантов. Обойти эту проблему можно посредством мутагенеза с
использованием олигонуклеотидов, что открывает путь к введению в ДНК
специфических точечных мутаций.
В 1978 г. было опубликовано две работы [21, 38], показавшие, каким
образом с помощью олигонуклеотидов можно осуществлять прецизионные
изменения в структуре ДНК. В обеих работах мутациям подвергался геном
бактериофага ФХ174. В зрелом вирусе ДНК этого фага находится в
одноцепочечной форме, но при инфицировании перед образованием новых фагов
превращается в двухцепочечную, или репликативную, форму (RF). Авторы [21,
38] использовали синтетические олигонуклеотиды, комплементарные к
вирусной ( + ) цепи, в качестве праймеров для синтеза in vitro
Белковая инженерия и ее приложения в биосенсорах
103
противоположной ( -) цепи и получения замкнутой кольцевой RF-молекулы,
включающей праймерный олигонуклеотид. Если праймер содержал неспаренное
основание, то RF ДНК все еще образовывалась, но тогда ее потомство было
двух типов-либо ДНК штамма "дикого-типа", либо ДНК, инициированная
неспаренным праймером. Последнюю отбирали скринингом на мутантный ген.
Позже этим методом в ФХ174 было введено несколько других мутаций [20].
Применение направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов
было в значительной степени ускорено двумя более поздними
усовершенствованиями. Первое из них относится к синтезу олигонуклеотидных
праймеров [49]. Были разработаны и запатентованы автоматические,
полуавтоматические и ручные методики твердофазного синтеза
олигонуклеотидов; рядом химических компаний стали выпускаться защищенные
активные, прекурсоры, и сейчас получение праймеров стало рутинной
процедурой. Второе достижение - стандартизация методологии использования
клонирующих векторов, получаемых из бактериофага М13 [60]. Последний,
подобно ФХ174, обладает как одноцепочечной, так и двухцепочечной формами
ДНК. Таким образом, представляющий интерес ген можно клонировать в RF-, а
подвергать мутагенезу в одноцепочечной форме. М13 особенно удобен в этом
отношении, так как он был специально разработан как клонирующий вектор
для выделения фрагментов ДНК при секвенировании ДНК методом терминации
цепи, развитым авторами [40]; кроме того, в нем имеется несколько
уникальных клонирующих сайтов [33]. Схема мутагенеза в М13 показана на
рис. 8.1.
В работе [54] показано, что используемые при мутагенезе олигонуклеотиды
можно использовать и как гибридизационные зонды для отбора мутантной ДНК.
Для этого в олигонуклеотид вводят метку радиоактивного 32Р. Поскольку
олигонуклеотид более гомологичен мутантной, а не нормальной ДНК "дикого
типа", он, очевидно, будет сильнее гибридизироваться именно с первой.
Мутантные клоны можно затем идентифицировать с помощью авторадиографии.
Выделение гена для представляющего интерес белка
Рис. 8.1. Схема олигонук-леотидного мутагенеза. Показаны основные стадии
мутагенеза при использовании бактериофага М13. Подробное описание
методики можно найти в работах, цитируемых в тексте.
Планирование в М13
Синтез
неспариваюицегося
олигонуклеотида
Получение
двухцепочечных
ДНК
Гибридизация
Репликация в E-coli; отбор и выделение мутантов; выделение
модифицированного белка
После идентификации мутантную ДНК можно вырезать из RF, реклонировать в
подходящей хозяин/векторной системе для максимального экспрессирования и
затем выделить кодируемый ею белок. Многократное повторение этого метода
позволяет внести в белок ряд изменений.
С помощью рассмотренного подхода был модифицирован ряд ферментов и
изучены свойства мутантов [1]. Одним из наиболее широко изучавшихся
примеров является тирозил-тРНК-синтетаза, поскольку ее структура и
кинетические свойства хорошо известны [15]. Фермент катализирует реакцию
аминоацилирования тРНК тирозином, протекающую в две стадии:
Фермент + тирозин + АТР -> фермент • аденилтирозин + PPi Фермент •
аденилтирозин + тРНК -* фермент + тирозил • тРНК + АМР.
Первые результаты [58] показали, что при замене цистеина-35 на серии
значение Км для АТР увеличивается в 4,5 раза. Аналогичная замена на
глициновый остаток также приводит к понижению ферментативной активности
[56]. Как известно из кристаллографических исследований, цистеин-35
образует водородную связь с рибозным кольцом АТР; таким образом,
неудивительно, что введение глицинового остатка приводит к снижению
активности. На первый взгляд результаты, полученные с серином, кажутся
странными, поскольку можно было бы ожидать, что способность гидроксила к
образованию более прочной водородной связи (по сравнению с
сульфгидрильной группой) приведет к усилению связывания АТР. Однако в
безлигандном ферменте водородные связи образуются с молекулами воды.
Разные стерические требования для сульфгидрильной и гидроксигрупп
означают, что в мутантном ферменте связывание АТР приводит к замене
сильной водородной связи на гораздо более слабую, откуда и следуют
