Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Тёрнер Э. -> "Биосенсоры: основы и приложения" -> 55

Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.

Тёрнер Э., Карубе И., Уилсон Дж. Биосенсоры: основы и приложения — М.: Мир, 1992. — 614 c.
Скачать (прямая ссылка): biosensoriosnoviiprilojeniya1992.djvu
Предыдущая << 1 .. 49 50 51 52 53 54 < 55 > 56 57 58 59 60 61 .. 355 >> Следующая

случае дигидрофолатредуктазы пролин-39 заменяли цистеи-ном. По-видимому,
между этим остатком и цистеином-85 образуется дисульфидный мостик, в
результате чего активность фермента зависит от его окислительного
состояния [53]. В Т4-лизосоме изолейцин-3 заменили на цистеин.
Картирование пептидов белка показало, что вновь введенный остаток
образует дисульфидную связь с цистеином-97. Ни замещение аминокислот, ни
образование мостика не отражается на активности фермента, хотя и
оказывает влияние на начальную скорость термической денатурации - у
мутантного фермента спад активности происходит медленнее, чем у
нормального. Интересно, что это различие, видимо, связано не с
дисульфидным мостиком как таковым, а с появлением тиольной группы
цистеина-54 [36].
Оптимальный интервал pH функционирования фермента можно сдвинуть путем
мутагенеза заряженных поверхностных групп, что было показано на примере
протео-лигического фермента субтилизина. Замещение поверхностного
аспартата серином привело к сдвигу связанной с активностью рКа от 7,17
для нормального фермента до
106
Глава 8
6,88 для мутантного [50]. Итак, для электростатического эффекта этот
сдвиг наблюдается только при низкой ионной силе. Методом
олигонуклеотидного мутагенеза недавно была изучена еще одна протеаза-
карбоксипептидаза А (СРА). В данном случае целью исследования была
проверка предполагаемой роли тирозина-248 в каталитической реакции [19].
При замене этого остатка фенилаланином kK.dT остается практически той же,
но наблюдается повышение Км (в 6 раз) и особенно (в 70 раз) константы
ингибирования ингибитором карбоксиоксидазы А картофеля.
Рассмотренные примеры показывают, что мы уже овладеваем возможностями
модификации аминокислотных последовательностей и, следовательно, свойств
белков, манипулируя их генами. Несомненно, в настоящее время приложению
этого подхода к биосенсорам препятствует недостаток как структурных
данных, так и подходящих клонированных генов. Потенциальная мощь генной
инженерии наряду с возможностью получения больших количеств материала
путем клонирования означает, что в области биосенсоров ее вклад будет
столь же велик, как уже велик он во многих других областях биотехнологии
(см. также гл. 7).
8.3. Модификация полипептидной цепи
Имеется много реагентов для модификации различных реакционных участков
полипептидной цепи. Некоторые из них приведены в табл. 8.1. Химическая
модифика-
Таблица 8.1. Типичные примеры химической модификации белков
Остаток Модификаторы
Лизин Арилирующие агенты, например тринитробензолсульфонат Ангидриды
кислот, например малеиновой, янтарной Изомочевины и имидаты
Аргинин аф-Дикетоны
Г истидин Диэтилпирокарбонат Алкилирующие агенты, например хлоркетоны
Цистеин Алкилирующие агенты, например иодоацетат, N-этилмалеи- нимид
Этилснимин
Тирозин Т етранитрометан Ацилирующие агенты, например ангидрид
уксусной кислоты, ацетилимидазол Иодирующие агенты, например иодид +
лактопероксидаза
Глутаминовая и аспарагиновая Карбодиимиды + амины
кислоты Диазосоединения
ция имеет важное значение для объяснения структуры и механизма
функционирования белков и мечения белка маркерными группами.
Соответствующие реагенты селективны в лучшем случае к аминокислотному
остатку определенного типа; в благоприятных случаях внешние факторы могут
подействовать таким образом, что один или два остатка этого типа станут
существенно более или менее реакционноспособными, чем остальные. Нацелить
реагент на активный центр можно, используя близкий структурный аналог
субстрата, несущий модифицирующую группу. Дальнейшее элегантное
усовершенствование этого метода заключается в том, что в процессе
катализа реакционноспособная группа "обнажается" и, таким образом,
получается субстрат-"самоубийца". В большинстве случаев при такой
модификации белок полностью утрачивает биологическую активность, так что
этот подход меньше всего подходит для
Белковая инженерия и ее приложения в биосенсорах
107
наших нужд при разработке биосенсоров. Существуют, однако, и менее
радикальные методы модификации белков, и ниже мы рассмотрим некоторые из
них.
8.3.1. Модифицирование с целью повышения активности фермента
Случаи такой модификации, как и можно было ожидать, довольно редки. На
первый взгляд может показаться странным, что активность фермента,
подвергавшегося эволюции миллионы лет, вообще может быть увеличена.
Следует, однако, помнить, что фермент создан для работы в определенной
внутриклеточной среде, а в условиях, заметно отличающихся от
внутриклеточных, его активность можно повысить. Так, в работе [37]
показано, что модификация в алкогольдегидрогеназе лизиновых остатков
метилпиколинимидатом приводит к 19-кратному повышению активности фермента
при высокой концентрации субстрата. После модификации кинетические
характеристики ферментативной реакции остаются такими же, как у нативного
фермента, причем диссоциация кофермента является лимитирующей стадией в
Предыдущая << 1 .. 49 50 51 52 53 54 < 55 > 56 57 58 59 60 61 .. 355 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed