Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
Последний также должен быть совместим с конечной конфигурацией и
технологией изготовления биосенсора. Наконец, даже если выбраны
подходящие носитель и реакции, используемые для иммобилизации, сама
иммобилизация может вызывать уменьшение конформационной подвижности и,
следовательно, активности белка.
8.3.7.2. Устойчивость. Принято считать, что иммобилизация приводит к
повышению устойчивости связанного белка по отношению к физическим и
химическим воздействиям. По данным [10], из 50 иммобилизованных ферментов
для 60% устойчивость увеличилась, для 16%-понизилась, а для 24%-не
изменилась. Следует иметь в виду, что устойчивость к термической
денатурации, протеолитическому разложению, экстремальным pH или
химической денатурации может отражать совершенно различные аспекты
разворачивания белков. Точно так же и устойчивость фермента при его
работе и хранении может зависеть от совершенно разных физических и
химических процессов. В настоящее время лучшим подходом к повышению
устойчивости фермента является эмпирический поиск. Но, чтобы выработать
стратегию иммобилизации фермента, может потребоваться детальное выяснение
причин потери его активности.
8.3.7.3. Отделение от окружающей среды. Обычно от носителя, на котором
проводится иммобилизация, требуется, чтобы он был просто инертной
подложкой для активного биологического материала. Можно, однако,
представить себе случаи, когда носитель играет более активную роль. В
определенных условиях он может обеспечить ферменту микроокружение,
отличное от окружения в объеме раствора. Весьма похожий эффект дает
обсуждавшаяся выше в этой главе поверхностная модификация белка.
Положительно заряженный носитель стремится потерять протоны, так что
кажущееся оптимальное для данного фермента значение pH будет ниже
обычного. Аналогичным образом гидрофобный субстрат стремится проникнуть в
гидрофобный носитель, что приводит к уменьшению кажущейся Км для этого
субстрата. С другой стороны, носитель можно разместить так, чтобы
исключить влияние мешающих веществ, присутствующих в анализируемой смеси.
Такие эффекты довольно легко предсказывать. Особенно важными они
становятся при разработке биосенсоров, удовлетворяющих самым строгим
критериям.
Белковая инженерия и ее приложения в биисенсорах
113
В заключение этого раздела, посвященного иммобилизации, мы должны
упомянуть иммобилизацию коферментов [34]. Одной из проблем, возникающих
при использовании биосенсоров со свободно диффундирующими коферментами,
является утечка последних из сенсора. Возможный способ решения этой
проблемы-иммобилизация кофермента в растворимой или нерастворимой форме.
8.4. Заключение
В этой главе мы постарались описать всевозможные способы изменения
свойств белков, которые могут сделать их более пригодными для
использования в биосенсорах. Самым мощным и универсальным методом
модификации белков бесспорно является олигонуклеотидный мутагенез. Однако
для конкретных ферментов, представляющих практический интерес,
информация, необходимая для целенаправленного использования этого метода,
обычно неполна либо вообще отсутствует. По правде говоря, до сих пор ни
один важный для биосенсоров фермент не был улучшен с помощью олигонук-
леотидного мутагенеза. Другой подход к модификации белков заключается в
целенаправленном изменении их поверхностных свойств. Такой подход может
широко применяться и давать предсказуемые результаты даже в отсутствие
кристаллографических данных. Подводя итог, мы можем уверенно предсказать,
что инженерия белков для биосенсоров, в настоящее время существенно менее
развитая, чем другие направления данной области, будет иметь важное
значение для разработки следующего поколения этих приборов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ackers G.K., Smith F. R. Effects of site specific amino acid
modification of protein interaction and
biological function. Ann. Rev. Biochem., 54, 597-629 (1985).
2. Barbehenn E. K., Kaufman В. T. Alteration of the properties of chicken
liver dihydrofolate reductase as a result of modification by
tetrathionate. J. Biol. Chem., 255, 1978-84 (1980).
3. Bolivar F., Rodriguez R. L" Greene R. J., Betlach М. С., Heyner H.
L., Boyer H. W., Crosa J. H., Fal-
kow S. Construction and characterisation of new cloning vehicles. II. A
multipurpose cloning system. Gene, 2, 95-113 (1977).
4. Bright H.J., Porter D.J.T. Flavoprotein oxidases. The Enzymes, XII,
421-511 (1975).
5. Burkey К. 0., Gross E. L. Chemical modification of spinach
plastocyanin: separation and characterization of four different forms.
Biochemistry (USA), 21, 5886-90 (1982).
6. Carlberg I., Mannervik B. Oxidative activity of glutathione reductase
effected by 2, 4,6-trinitroben-zenesulfonate. FEBS Lett., 115, 265-8
(1980).
7. Carr P. W., Bowers L. D. Immobilised enzymes in analytical and
clinical chemistry. Wiley, New York,
1980.
8. Carter P.J., Winter G., Wlkinson A.J., Fersht A.R. The use of double
mutants to detect structural changes in the active site of the tyrosyl-
