Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
2. Сдвиг или устранение зависимости от pH.
3. Изменение диапазона линейной зависимости отклика сенсора от
концентрации субстрата.
4. Повышение стабильности при хранении и функционировании.
5. Снижение восприимчивости к мешающим веществам.
6. Расширение или сужение субстратной специфичности.
7. Изменение потребности в кофакторах.
В настоящей главе дан обзор различных подходов, используемых для
модификации белков. Мы начнем с уровня нуклеотидной последовательности
ДНК и постепенно продвинемся дальше. Обсуждаемые примеры не связаны с
биосенсорами как таковыми. Однако они позволят проиллюстрировать
некоторые результаты, достигнутые в области изменения свойств белков.
С самого начала следует уяснить, что белковая инженерия, т. е.
направленная модификация белка, вообще возможна лишь при наличии
детальной информации о нем. В идеальном случае предполагается, что
третичная структура белка известна с разрешением, достаточным для
локализации отдельных аминокислотных остатков. К сожалению, для многих
белков, используемых в биосенсорах, такие данные либо вообще отсутствуют,
либо их не хватает. Так, мы все еще довольно мало знаем о молекулярной
структуре глюкозооксидазы - вероятно, наиболее широко используемого в
биосенсорах, легко доступного (причем в весьма чистом виде и в
достаточных количествах) фермента. До сих пор не описаны ни его
аминокислотная последовательность, ни кристаллическая структура.
Кинетические свойства глюкозооксидазы хорощо изучены [4], однако эта
информация не опирается ни на какие структурные данные. Недостаток таких
сведений означает, что нам часто трудно не только действительно
конструировать белковые молекулы, но даже интерпретировать эффекты,
вызванные модификацией на эмпирическом уровне.
Имея в виду это предостережение, мы все же полагаем, что инженерия
белковых молекул для биосенсорных приложений - предмет достаточно важный
для серьезного обсуждения. В конце концов молекулы белков возникли для
выполнения определенных биологических функций, а не для того, чтобы
служить частями наших приборов. Хотя какие-то биологические свойства и
могут использоваться в наших целях, не удивительно, что другие
оказываются при этом более или менее чужеродными.
Помня обо всем этом, приступим к обозрению подходов и методов белковой
инженерии.
8.2. Модификация на уровне ДНК
С начала 70-х гг., когда было показано, что ДНК можно расщепить на
фрагменты и затем снова соединить in vitro, рекомбинантные ДНК стали
важным инструментом молекулярной биологии [11]. В настоящее время методы
генной инженерии позволяют изолировать, размножить и "прочитать"
(определить нуклеотидную последовательность) любой нужный ген,
принадлежит ли он растению, животному или микроорганизму. Зная
нуклеотидную последовательность ДНК представляющего интерес гена, мы
можем затем установить аминокислотную последовательность кодируемого им
белка. Верно и обратное - для любой требуемой полипептидной цепи можно
создать соответствующую нуклеотидную последовательность. Для относительно
небольших пептидов в 1981 г. осуществлен химический синтез гена in vitro
[14]. Таким образом, не существует теоретических препятствий к
конструированию генов, кодирующих новые функции. Трудности возникают,
если нужно синтезировать длинные полинуклеотиды - с приемлемым выходом,
не загрязненные побочными продуктами сходного строения, а также при
проектировании полипептидной последовательности, обеспечивающей желаемые
функции. Мы еще очень мало знаем о факторах, определяющих упаковку белка.
Поэтому сейчас мы ограничиваемся модификацией существующих белков путем
замены нуклеотидов в соответствующих областях гена.
Внесение изменений в первичную структуру ДНК, а не белка, имеет ряд
преимуществ. Во-первых, поскольку ДНК-это генетический материал, который
точно воспроизводится в ходе роста микроорганизмов, его нужно получить
лишь один раз. Модификацию самого белка пришлось бы проводить
многократно, нарабатывая новые порции. Во-вторых, любое изменение гена
приводит к единственном)' продукту, тогда как при химической модификации
белка часто получается смесь веществ. Наконец, генетическими методами в
белке можно заменить любую аминокислоту, химической же модификации белка
могут препятствовать стерические или кинетические барьеры. Подход,
связанный с мутагенезом in vitro, заключается в том, чтобы осуществить
точечные мутации гена в одном или ограниченном числе сайтов и проследить,
как это скажется на соответствующем белке.
Один из методов химического мутагенеза использовали для замены цитозина
на тимин. Для этого ДНК обрабатывали бисульфитом натрия, который при
подходящих условиях действует лишь на специфический участок ДНК [43].
Созданы также методы, позволяющие воздействовать на относительно
специфические участки нуклеотидной последовательности одноцепочечной ДНК
и, после ресинтеза, включать неспари-вающиеся или "неправильные"
основания [44]. Однако в этих методах нельзя точно задать положение точки
